C^—
۲
۲
۱
شکل۵-۳- واکنش زنجیره­ای پلیمراز برای تکثیر ژن‏های hrpG , hrpW با آغازگرهای اختصاصی و آنزیم pfu دی.ان.آ پلیمراز

L: مارکر Kb1، ۱: hrpW، ۲: hrpG
تایید ناقل­های کلونینگ و بیانی از طریق الگوهای برشی حاصل از هضم توسط آنزیم‏های برشی نوع II
با توجه به اینکه ناقل­های مذکور از گروه‏های پژوهشی موجود در مرکز ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری و همچنین پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی تهیه شده، لذا، می­بایست از هویت آنها اطمینان حاصل می­شد که بدین منظور و با بررسی توالی ناقل­های مربوطه موجود در بانک اطلاعاتی NCBI توسط برنامه Vector NTI مشخص گردید که تنها یک جایگاه برای هر کدام از آنزیمهای برشی SacI , XbaI به ترتیب در نوکلئوتیدهای ۳۱ و۹۱ مربوط به جایگاه همسانه‏سازی pGEM7zf(-) و همچنین جایگاه ۵۸۱۵ و۷۷۱۵ از pBI121 وجود دارد. علاوه بر آن جایگاه‏های BamHI , XbaI نیز در موقعیت ۲۵۷ و ۲۶۳ مربوط به توالی جایگاه همسانه‏سازی ناقل pUC19 به‏صورت یگانه می­باشند. به‏دنبال این موضوع واکنش هضم آنزیمی با آنزیم­ های مذکور و بر روی ناقلین مربوطه صورت گرفت که نتایج حاصله از هضم دوتایی هر کدام در شکل (۶-۳) قابل مشاهده می­باشد، که تایید کننده ناقلین مورد استفاده و در راستای اطلاعات نظری حاصل از سایت­های اطلاعاتی مربوطه می­باشد.
۱۳۷۵bp
۳۰۰۰bp
۲۷۹۳bp
۲۷۹۹bp
۱.۸kb
۱۳.۸kb
۱۲kb
۴
L
۳
۲
۱
۶
۵
شکل۶-۳- الکتروفورز محصول هضم آنزیمی ناقلین کلونینگ و بیانی با آنزیم­ های برشی نوع II بر روی ژل آگارز ۱%
L: مارکر Kb1، ۱: هضم دوتایی pUC19، ۲: pUC19 بدون برش، ۳: هضم دوتایی pGEM7zf(-)، ۴-۵: هضم دوتایی pBI121 (BamHI , XbaI)، ۶: هضم دوتاییpBI121 (SacI , XbaI).
همسانه‏سازی ژن­هایhrpG و hrpW در ناقل­های کلونینگpGEM7zf(-) و pUC19
با دریافت توالی کامل پلاسمید pGEM7zf(-) با شماره دستیابی X65311 و همچنین pUC19 از سایت NCBI، طراحی آنها در برنامه رایانه­ای Vector NTI انجام شد. جهت همسانه‏سازی ژن hrpW در pGEM7zf(-) و همچنین hrpG در pUC19 ابتدا این ناقل‏ها را با کشت باکتری میزبان آنها یعنی E.coli بر روی محیط کشت LB حاوی آنتی‏بیوتیک آمپی‏سیلین و همچنین X.gal 2% و IPTG 20% به مدت یک شبانه روز در دمای ۳۷ درجه قرار دادیم با ظهور کلون‏های آبی رنگ و کشت از آنها، پلاسمیدهای موردنظر استخراج شدند و پس از آن به منظور کلون کردن ژن­های مذکور در این ناقل­ها جهت حفظ و نگهداری آن در ناقل با تعداد کپی بالا، فراورده تکثیر شده و ناقل مربوطه با آنزیم‏های XbaI / BamHI , XbaI / SacI و به مدت ۴-۳ ساعت در بن‏ماری با دمای ۳۷ درجه هضم شدند، که پس از آن با بردن محصول بر روی ژل آگارز ۱% و بازیابی، تعیین غلظت و کیفیت آن با الکتروفورز ۵ مایکرولیتر از محصول بازیابی شده نسبت‏های ۱ به ۳ را برای pGEM/hrpW و نسبت ۱ به ۴ برای pUC19/hrpG جهت انجام واکنش اتصال انتخاب شد.
L
۴
۳
^‘
L
۱
۲
۷۹۲bp
۹۱۲bp
۹۱۲bp
۷۹۲bp
الف
ب
شکل۷-۳- هضم آنزیمی فراورده ژن­های hrpG , hrpW جهت بازیابی از روی ژل آگارز )الف) و قطعات بازیابی شده (ب)
L: مارکر Kb1، ۱: hrpW، ۲: hrpG، ۳: قطعه‏ی برش خورده hrpW، ۴: قطعه‏ی برش خورده hrpG

L
۴
۳
۲
۱
L
۲۷۹۹bp
۳۰۰۰bp
۳۰۰۰bp
۲۷۹۹bp
ب
الف
۱
شکل۸-۳- هضم آنزیمی ناقل‏های کلونینگpUC19 و pGM7zf(-) جهت بازیابی از ژل آگارز (الف) قطعات بازیابی شده (ب)