شکل ۱-۴: تظاهرات کلینیکی بیماریهای با عامل Hib بصورت درصد
به عنوان مثال برخی سویه های غیر کپسولدار گاهی قادر به ایجاد مننژیت در بزرگسالان هستند به خصوص در افراد ناتوان یا با ضعف سیستم ایمنی. علاوه بر آن می توانند در نوزادان ایجاد کننده سپسیس و در کودکان عامل عفونت های تهاجمی دستگاه تنفسی تحتانی باشند. دیگر سروتایپ های هموفیلوس آنفلونزا نیز به ندرت در انسان بیماریزا هستند (۱۰،۷۴).
۱-۶-۱: مننژیت
مننژیت مهمترین و خطرناکترین بیماری است که توسط هموفیلوس آنفلونزا ایجاد می شود. سروتایپ b از هموفیلوس آنفلونزا معمول ترین عامل مننژیت در بین کودکان بین ۳ ماه تا ۶ سال می باشد (۷۵). مننژیت ناشی از این باکتری شایع ترین شکل مننژیت سپتیک بوده که تقریبا در همه موارد به وسیله تیپ b ایجاد می شود(۸). بطور مشخص، مننژیت هموفیلوسی پس از بیماری ضعیف چند روزه رخ می دهد و علائم بیماری ممکن است قطع شده و دوباره پدیدار شود. مرگ و میر در ارتباط با هموفیلوسی حدود ۵-۳% می باشد(۲۵). علائم مننژیت ایجاد شده توسط این باکتری با سایر مننژیتهای باکتریایی در کودکان کمتر از ۳ سال تفاوتی ندارد و مفصل در موارد کمتری گرفتار می شوند(۹).
در طی بیماری مننژیت با عامل هموفیلوس آنفلونزا تیپ b، به دنبال کلونیزه شدن، تهاجم به جریان خونی و در نتیجه انتشار باکتریمی اتفاق می افتد. همچنین ارگانیسم در غشاء مخاط تنفسی شروع به تکثیر می کند.
از علائم این بیماری می توان سردرد، سفت شدن گردن^[۹]، تب وبی حالی، شوک و دیگر علائم رایج مننژیتی را نام برد(۲۰). عواقب دراز مدت مننژیتی ناشی از این باکتری پراهمیت می باشد. بازماندگان، قریب یک سوم عوارض عصبی و روانی از جمله کری، اختلال در بیان و ناهنجاری های رفتاری پیدا می کنند و درصد کمی از بیماران نیز شدیداً آسیب دیده و به مراقبت های ویژه نیاز پیدا می کنند(۸).
۱-۷:درمان:
۱-۷-۱: واکسن های موثر و مقایسه آنها
قبل از معرفی واکسن های موثر، تقریبا از هر ۲۰۰ کودک بین ۵-۱ سال، ۱ کودک مبتلا به بیماری های تهاجمی Hib می شد. اما امروزه در کشوری مثل آمریکا، این میزان به ۱ کودک در هر ۱۰۰۰۰۰ کودک تقلیل یافته است. که معمولا این میزان ابتلا نیز با عاملی غیر از سروتایپ b از این ارگانیسم رخ می دهد. اما متاسفانه هنوز در کشورهایی که توانایی اقتصادی برای واکسیناسیون عمومی موجود نیست، بیماری های با عامل Hib همچنان قربانی های زیادی دارد (۷۸).

اولین نسل از واکسن های علیه بیماری های Hib، شامل پلی ساکاریدی خالص از جنس PRP با وزن مولکولی بالا بود که در سال ۱۹۸۵ در آمریکا معرفی شد (۸۰). اما این واکسن که اولین واکسن تحت لیسانس به حساب می آید مانند دیگر واکسن های پلی ساکاریدی، پاسخ ایمنی به آن نیز وابسته به سن بود. بدین معنی که با وجود تاثیر قابل قبول در کودکان تازه به راه افتاده ، در نوزادان زیر ۱۸ ماه قادر به ایجاد حفاظت نبود. این واکسن در سال ۱۹۸۸ از دور فروش خارج شد (۷۶).
پس از ظهور کوتاه واکسن های پلی ساکاریدی ، نسل دوم واکسن های Hib به بازار آمد. این نسل از واکسن‌ها کونژوگه ای بود از پلی ساکارید PRP با یک حامل پروتئینی در حالت کوالانت بود.
اتصال پلی ساکارید به حامل پروتئینی ، به طور چشمگیری باعث افزایش توانایی سیستم ایمنی کودکان در شناسایی PRP و پاسخ به آن می شود (۷۹). امروزه سه نوع مختلف از واکسن های کونژوگه وجود دارد که در هر کدام یک نوع پروتئین در پروسه کونژوگه کردن استفاده شده است و شامل: توکسوئید تتانوس (PRP-T)، پروتئین موتانت دیفتری(PRP-D) و پروتئین غشاء خارجی مننگوکوکی گروه b (PRP-ompc) است.
PRP-D (کپسول همراه با توکسوئید دیفتری) در نوزادان، حتی بعد از تزریق ۳ دوز، از کمترین ایمنی زایی برخوردار بود. اما وقتی به عنوان یک بوستر در نوزادان ۱۲-۱۸ ماهه که در دوره اولیه سه تزریق آنها توسط PRP با کونژوگه دیگری بود، مورد استفاده قرار گرفت، ایمنی زایی خوبی را از خود نشان داد (۵۸).
PRP-ompc یا کپسول کونژوگه با پروتئین غشاء خارجی بدست آمده از مننگوکوک، تنها کونژوگه ای است که آنتی بادی بالایی را پس از اولین تزریق در نوزادان دوماه سبب می شود. دوزهای بعدی، افزایش نسبتا کمی را تولید کرده و آخرین تیتر حتی کمتر از بقیه.(۲۴)
واکسن PRP-T و واکسن کونژوگه کپسول به همراه توکسین به دست آمده از موتانت دیفتری، هر دو آنتی بادی کمی را پس از تزریق به نوزادان ۴-۲ ماه تولید می کنند. در حالی که میزان آنتی بادی بالایی را پس از تزریق در ۶ ماهگی تولید می کنند. بنابر این از نظر تئوری، یک تزریق اولیه PRP-ompc در ۲ ماهگی و تزریق دوم با PRP-T و یا با PRP متصل به توکسین موتانت دیفتری در سن ۶-۴ ماهگی و سومین تزریق با PRP-D در ۱۵-۱۲ ماهگی، می تواند پاسخ مطلوبی را به همراه داشته باشد (۵۰).
جدا از هر نوع واکسنی که برای دوزهای اولیه انتخاب می شوند، زمانی که کودک در کمتر از ۱۲ ماهگی است، تیترها به سرعت پایین می آیند، مگر در زمان یک تزریق مجدد (بوستر) که معمولا در ۱۵-۱۲ ماهگی صورت می پذیرد (۵۶).
به منظور کاهش تعداد دفعات ضروری تزریق واکسن به کودکان نسل سوم این واکسن ها به تایید سازمان بهداشت جهانی (WHO^[10]) رسیده که واکسنی پنتاوالانی (پنج ظرفیتی) است که ترکیبی از واکسن های مختلف از جمله دیفتری، تتانوس، سیاه سرفه و هپاتیت می باشد، اما هنوز مدارک و شواهد کافی در مورد تفاوت اثر این واکسن ها در مقایسه با واکسن های اختصاصی وجود ندارد (۷۶، ۷۷).
در مطالعه ای که بر روی نوزادان گامبیایی صورت گرفته است، اثر واکسن های کونژوگه Hib در این کشور در حال توسعه نشان دهنده کاهش بیماری و جلوگیری از اکثر موارد مننژیتی و پنومونی می باشد. بنابراین پیشنهاد شده است که این واکسن ها در کشور های در حال توسعه، مرگ و میر ناشی از این بیماری ها را در کودکان به طور قابل توجهی کاهش می دهد (۵۲).
شکل ۱-۵: کشورهایی که از سال ۱۹۹۷ تا ۲۰۱۲ به برنامه واکسیناسیون علیه Hib پیوستند(۳۶)
۱-۸: تشخیص:
تشخیص این باکتری در آزمایشگاه به طور معمول با بهره گرفتن از دو روش کشت و تست آگلوتیناسیون لاتکس^[۱۱] (LAT) انجام می شود. روش مولکولی PCR نیز قابل انجام است که به صورت روتین در آزمایشگاه های تشخیصی انجام نمی شود.
۱-۸-۱: روش کشت
کشت باکتریایی Hi بر روی آگار شکلاته به همراه فاکتور X ^[۱۲] و V ^[۱۳] در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد و غنی از Co₂ انجام می شود. رنگ آمیزی گرم و مشاهده میکروسکوپی، باکتری را به صورت باسیل های گرم منفی نشان می دهد.
باکتری از نظر تولید آنزیم های اکسیداز و کاتالاز، مثبت است.
در ناحیه همولیتیک استاف اورئوس^[۱۴] در محیط بلاد آگار رشد می کند زیرا در این ناحیه به دلیل همولیز خون، فاکتورV وجود دارد.
در محیط لوینتال^[۱۵] سویه های کپسول دار کلنی های با نمای رنگین کمانی تولید می کنند. محیط فیلدز آگار^[۱۶] بهترین محیط برای جدا سازی این باکتری می باشد.
۱-۸-۲: روش آگلوتیناسیون لاتکس (LAT)
روش حساس تری نسبت به کشت می باشد زیرا این روش بر پایه آنتی ژن های باکتری های زنده انجام می شود که با آنتی بادی اختصاصی خود واکنش می دهد .
نتایج در این روش تحت تاثیر مصرف آنتی بیوتیک ها قرار نمی گیرد. همچنین این روش سریع تر از روش کشت بوده و قادر به تمایز سروتایپ های مختلف کپسول دار می باشد. با این حال نتایج آن نسبت به روش مولکولی از دقت کمتری برخوردار است (۳۵).
۱-۸-۳: روش مولکولی
واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) بسیار حساس تر، اختصاصی تر و سریع تر از روش کشت و LAT می باشد (۳۵،۵۱). طراحی پرایمر برای شناسایی مولکولی سروتایپ های هموفیلوس آنفلونزا برای اولین بار در سال ۱۹۹۰ توسط وَن کِتِل^[۱۷] و همکاران انجام شد (۷۱). با این حال روش PCR هنوز به صورت روتین در آزمایشگاه ها مورد استفاده قرار نمی گیرد.
۱-۹: ژنوم هموفیلوس آنفلونزا:
هموفیلوس آنفلونزا اولین موجود زنده دارای توانایی تکثیر مستقل است که ژنوم آن به طور کامل تعیین توالی شد. پروژه ژنوم هموفیلوس آنفلونزا در سال ۱۹۹۵ توسط ونتر^[۱۸] همکاران انجام شد.
هموفیلوس آنفلونزا به این دلیل انتخاب شد که یکی از سرپرست های پروژه به نام همیلتون اسمیت^[۱۹] (برنده نوبل) یک دهه بر روی این میکروارگانیسم کار کرده بود و اطلاعات زیادی در مورد آن وجود داشت که برای موفقیت پروژه لازم بود.
ژنوم هموفیلوس آنفلونزا در یک کروموزوم حلقوی قرار گرفته که دارای ۱۸۳۰۱۳۷ جفت باز است. این تعداد نوکلئوتید تشکیل ۱۷۴۰ ژن کد کننده پروتئین، ۲ ژن کد کننده tRNA و ۱۸ ژن کد کننده RNA را می دهد.
برای توالی یابی ژنوم از تکنیک shutgun sequencing استفاده شد. این پروژه یک سال طول کشید و در این مدت ۲۴۳۰۴ قطعه به صورت مجزا توالی یابی و سپس توسط نرم افزار کنار هم قرار داده شدند(۷۲).
شکل ۱-۶: نقشه ژنتیکی حلقوی Haemophilus influenza Rd
۱-۹-۱: ژنوم مولد کپسول پلی ساکاریدی
انواع هموفیلوس آنفلونزای کپسول دار دارای ژن های مشترک برای تولید کپسول پلی ساکارید^[۲۰] مربوط به خود هستند که در جایگاه cap (cap locus) قرار گرفته اند(۴۲).
جایگاه cap یک منطقه ۱۸kb است که در همه سروتیپ ها دارای سه منطقه عملکردی جداگانه به نام های منطقه I,II.III می باشد (شکل ۱-۷).

شکل ۱-۷: ساختار ژنتیکی جایگاه cap در هموفیلوس آنفلونزا سروتایپ های a,b,c,d,e,f
منطقه I و III در همه سروتایپ های کپسول دار مشترک است و شامل ژن هایی است که برای تولید و ترشح کپسول پلی ساکاریدی ضروری هستند. مشابه این ژن ها در باکتری های گرم منفی دیگر از قبیل
Escherichia coli, Neisseria meningitides, Actinobacillus pleuropnumoniae, Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida دیده شده است. (۶۳)
۱-۹-۱-۱: منطقه I