۴-۳-۱- واکنش زنجیره‌ای پلیمراز برای تایید وجود ژن لاکتوفرین در گیاهان تراریخت ۳۹

۴-۴- استخراج RNAو ساخت cDNA 40
۴-۵- انجام Real Time PCR 42
۴-۵-۱- انجام Real Time PCR برای ژن لاکتوفرین ۴۲
 ویروس موزاییک خیار ۴۳
۴- ۴۶
۶- بحث ۴۷
۷- منابع ۴۹
فهرست جدول‌ها
عنوان …………. صفحه
جدول ۳-۱- محول ضدعفونی کننده بذر توتون ۱۶
جدول ۳-۲- تهیه ی بافر استخراج DNA 19
جدول ۳-۳- پرایمرهای مورد استفاده برای تکثیر و تایید ژن لاکتوفرین ۲۰
جدول ۳-۴- سیکل گرمایی استفاده شده در هر واکنشPCR 21
جدول ۳-۵- مواد استفاده شده در هر واکنش PCR 22
جدول ۳-۶- نوع و میزان مواد به کار رفته برای تیمار DNase 25
جدول ۳-۷- مواد مورد استفاده در مرحله اول سنتز cDNA 26
جدول ۳-۸- مواد مورد استفاده در مرحله دوم سنتز cDNA 27
جدول ۳-۹- آغازگرهای به کار رفته ژن لاکتوفرین برای Real-Time PCR و ژن کنترل داخلی ۲۷
جدول ۳-۱۰- میزان مواد به کار رفته در Real –Time PCR ژن لاکتوفرین و ژن Ef به عنوان کنترل داخلی…… ۲۸
جدول ۳-۱۱- سیکل گرمایی استفاده شده در Real-Time PCR ژن لاکتوفرین و ژن کنترل داخلی ۲۹
 ویروس موزاییک خیار و ژن Ef به عنوان کنترل داخلی ۳۰
 ویروس موزاییک خیار و ژن کنترل داخلی ۳۰
جدول ۴-۱- تاخیر ظهور علایم پس از ۱۵ روز از مایه زنی ویروس موزاییک خیار در گیاهان تراریخت ۳۶
فهرست شکل ها
عنوان……………………………………………………………………………………………………………………………… صفحه
شکل ۴-۱- ظهور علایم در توتون های تیپ وحشی ۳۳
شکل ۴-۲- گیاهان تراریخت هنگام ظهور علایم در تیپ وحشی‌ها ۳۴
شکل ۴-۳- گیاهان تیپ وحشی بعد از ۳۰ روز مایه زنی ویروس موزاییک خیار ۳۴
شکل ۴-۴- گیاهان تراریخت پس از ۱۵ روز از ظهور علایم در تیپ وحشی­ها ۳۵
شکل ۴-۵- آزمون الایزا در زمان صفر ۳۷
شکل ۴-۶- رشد ویروس در تراریخت ها و تیپ وحشی در ۲۰ روز بعد ازمایه زنی ویروس موزاییک خیار ۳۸
شکل ۴-۷- آزمون الایزا در زمان ۳۰ روز بعد مایه زنی ویروس موزاییک خیار ۳۹
شکل ۴-۸- نقوش الکتوفروزی محصول PCR با پرایمرهای partial ژن لاکتوفرین ۴۰
شکل ۴-۹- استخراج RNA از گیاهان تراریخت و تیپ وحشی ۴۰
شکل ۴-۱۰- نقوش الکتروفورز PCR آغازگرهای Real-Time با آغازگرهای ژن لاکتوفرین: ۴۱
شکل ۴-۱۱- تیمار DNase توتون تیپ وحشی پس از ۲۲ روز از مایه زنی باکتری ۴۱
شکل ۴-۱۲- نتایج حاصل از Real-Time PCR ژن لاکتوفرین در لاین­های تراریخت ۴۲
 ویروس موزاییک خیار ۴۳
شکل ۴-۱۴- کشت عصاره ی حاصل از گیاهان تراریخت و تیپ وحشی ۴۴
شکل ۴-۱۵- پژمرده گی گوجه پس از ۲۶ روز از مایه زنی باکتری ۴۵
 ۴۵
 ۴۵
فصل اول
۱-­ مقدمه
براساس یک تخمین محافظه کارانه، بیماری­ها، حشرات و علف های هرز در سطح جهانی سالانه بین ۳۱ تا ۴۲% محصولات کشاورزی را نابود کرده و یا از تولید آن­ها جلوگیری می­ کنند. میزان خسارت به طور معمول در کشورهای پیشرفته و در کشورهای در حال پیشرفت که نیاز غذایی بیشتری دارند، بالاتر است (Tisdell and Xiang, 1998). اگر متوسط میزان خسارت را ۵/۳۶% بگیریم، سهم بیماری ها، حشرات و علف های هرز دراین خسارت به ترتیب ۱/۱۴%، ۲/۱۰% و ۲/۱۲% شده است. با توجه به اینکه بیماری ها به تنهایی موجب نابودی ۱/۱۴% محصولات می شوند، مقدار خسارت سالانه آن­ها در سطح جهانی بالغ بر۲۲۰ میلیارد دلار می شود (Wood and Derek, 2001).
طی یک صد سال گذشته، کنترل بیماری­ها و سایر آفات گیاهی به طور فزاینده­ای به استعمال مواد شیمیایی سمی وابسته است. کنترل بیماری­های گیاهی اغلب کاربرد این مواد سمی را نه تنها بر روی گیاه و محصولات گیاهی مورد استفاده­ی ما، بلکه درون خاک جایی که بسیاری از میکروارگانیزم­های بیماری­زا زندگی کرده و به ریشه­ گیاه حمله می­ کنند، ضروری ساخته است. بسیاری از این مواد شیمیایی برای میکروارگانیزم­های غیر هدف، حیوانات و حتی برای انسان نیز ممکن است سمی باشند. دشوار است که بتوان هزینه­ های بلند مدت و کوتاه مدت آلودگی محیط زیست بر سلامتی و به­زیستی انسان را که براثر تلاش ما برای کنترل بیماری های گیاهی و سایر آفات به وجود می آید، تخمین زد. شمار زیادی از بیمارگرهای گیاهی از ویروئیدهای دارای چند صد نوکلئوتیدی تا گیاهان عالی در محصولات کشاورزی ایجاد بیماری می­ کنند. دامنه­ اثرات این بیماری زا از اثرات خفیف تا نابودی کامل محصول است. گروه ­های عمده بیمارگرها شامل ویروس­ها، باکتری­ ها، قارچ­ها، اوومیست­ها، ویروس­ها و نماتدها می­باشند. کنترل عوامل بیماری­زای گیاهی مشکل است زیرا جمعیت آنها بسته به زمان، مکان و نوع ژنوتیپ متغیر است. بنابراین برای مبارزه با تلفاتی که آن­ها به وجود می ­آورند، لازم است به تعریف مشکل پرداخت و به دنبال راه­حل­هایی بود. در سطح زیستی نیاز به روش­هایی برای تشخیص دقیق و سریع اورگانیزم ایجاد کننده­، بیماری تخمین دقیق شدت بیماری، اثر بیماری روی محصول و تشخیص مکانیسم ­های بیماری­زایی می­باشد. در مرحله­ بعد خسارت بیماری باید به وسیله­ کاهش مایه تلقیح بیمارگر، کاهش مکانیسم های بیماری­زایی آن و افزایش گوناگونی ژنتیکی در محصول به حداقل برسد (Reed et al., 2003). هدف بیشتر پژوهش­های جدید در بیماری­شناسی گیاهی یافتن شیوه ­های دیگر برای کنترل بیماری­های گیاهی است که به محیط زیست آسیب کمتری برسانند. روش­های انتقال در سال­های اخیر به عنوان یک موضوع مهم برای ایجاد مقاومت مورد بررسی قرار گرفته است. امید ­بخش­ترین این روش­ها عبارتند از: