قبل از باز کردن تیوب حاوی DNA ، ابتدا به مدت کوتاهی تیوب سانتریفیوژ شد تا DNA های متصل به دیواره جدا شوند. در صورت عدم سانتریفیوژ ممکن است مقداری از ذخیره ی DNA از دسترس خارج شود.
استوک اصلی : ۱۰ میکروگرم از DNA لیوفیلیزه در ۱۰۰ میکروگرم از بافر TE حل شد.
استوک مورد استفاده : در یک میکروتیوب دیگر ۱ میکروگرم از استوک اصلی در ۱۰میکروگرم از بافر TE حل شد. (غلظت نهایی به ۱۰ رسید).
۳-۴ کلونینگ پلاسمید AMP–pBSK حاوی DNACD166
جهت تکثیر پلاسمید حاوی ژن CD166 مراحل زیر طی شد :
۳-۴-۱ آماده سازی باکتری شایسته
جهت آماده سازی باکتری Top 10 برای پذیرش پلاسمید ابتدا باید آن را کامپتنت یا شایسته سازی ، برای پذیرش پلاسمید کرد.

۳-۴-۱-۱ مواد و محلول ها
محلول کلرید کلسیم ۱/۰ مولار
LB براث بدون آنتی بیوتیک
LB براث حاوی آمپی سیلین (پس از ساخت براث و سپس سرد شدن آن بعد از اتوکلاو کردن ، آمپی سیلین به محیط کشت افزوده شد. غلظت آمپی سیلین باید حدود ۱۰۰ میکروگرم در هر میلی لیتر باشد)
LB آگار حاوی آمپی سیلین (روش تهیه دقیقا مشابه LB براث است)
۳-۴-۱-۲ روش کار
باکتری در محیط کشت فاقد آمپی سیلین کشت داده شد.
پس از ۲۴ ساعت نگهداری در انکوباتور ، یک تک کلونی را انتخاب کرده و به ۵ میلی لیتر محیط LB مایع بدون آمپی سیلین تلقیح می کنیم و سپس به مدت یک شب تا صبح در شکیرانکوباتور قرار می دهیم تا باکتری رشد کنند.
یک میلی لیتر از محیط فوق را به ۵ میلی لیتر محیط LB تازه تلقیح نموده و مجددا در شیکرانکوباتور قرار می دهیم. ۲ تا ۳ ساعت بعد محیط کدورت مناسب یعنی جذب ۵/۰ تا ۸/۰ در ۵۰۰ نانومتر را به ما می دهد.
باکتری هایی که به این طریق تازه گشته و در فاز لگاریتمی تکثیر می باشند را در چند میکروتیوب استریل توزیع کرده و ۵ الی ۱۰ دقیقه روی یخ نگه می داریم.
میکروتیوب ها را ۳ دقیقه در ۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم.
مایع رویی را دور ریخته و رسوب باکتری را در یک میلی لیتر محلول استریل ۱/۰ مولار کلرید کلسیم حل می کنیم.
۲۰ تا ۳۰ دقیقه محلول مذکور را روی یخ انکوبه می کنیم.
این بار رسوب را در ۶۰۰ میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل ۱/۰ مولار حل می کنیم.
۲۰ تا ۳۰ دقیقه محلول را روی یخ انکوبه می کنیم.
سپس محلول را به مدت ۳ دقیقه در ۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم.
رسوب را در ۳۰۰ میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل حل می کنیم.
به مدت ۲۰ دقیقه محلول را بر روی یخ قرار می دهیم.
این باکتری ها تا ۷۲ ساعت روی یخ در یخچال قابل نگهداری می باشند و می توان با افزودن گلیسرول استریل ۳۰ درصد آنها را در ۷۰- درجه سانتیگراد به مدت چند ماه نگهداری کرد.
۳-۴-۲ ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد E.coli TOP10
بدین منظور از سویه E.coli TOP10 که یکی از رایج ترین سویه های کلونینگ است استفاده می کنیم. این باکتری به تنهایی حساس به آمپی سیلین است ولی وقتی وکتور را جذب کند نسبت به آنتی بیوتیک مقاوم شده و بر روی آگار حاوی آمپی سیلین تشکیل کلونی می دهد.
۳-۴-۲-۱ روش کار :
مراحل کار به ترتیب زیر است :
۵۰ میکرولیتر سوسپانسیون سلولی شایسته را ابتدا روی یخ ذوب می کنیم.
۲ میکرولیتر از پلاسمید AMP–pBSK حاوی DNACD166 را به آن اضافه می کنیم.
این مخلوط را به مدت ۳۰ دقیقه روی یخ انکوبه می کنیم.
نمونه ها را به مدت ۹۰ ثانیه در بن ماری ۴۲ درجه سانتیگراد قرار می دهیم و بلافاصله به روی یخ منتقل می کنیم و ۵ دقیقه اجازه می دهیم بدون حرکت روی یخ بماند.
مخلوط فوق را به ۹۰۰ میکرولیتر از محیط LB فاقد آمپی سیلین افزوده و آن را به مدت ۵/۱ ساعت در شیکر انکوباتور ۳۷ درجه قرار می دهیم تا باکتری های ترانسفورم شده بتواند شروع به تکثیر نمایند.
مخلوط فوق را به مدت ۳ دقیقه در ۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم.
۷۰۰ میکرولیتر از مایع رویی را دور ریخته و رسوب را در ۲۵۰ میکرولیتر باقی مانده خوب حل می کنیم.
۱۰۰ میکرولیتر را روی یک پلیت LB آگار و ۱۵۰ میکرولیتر را روی یک پلیت دیگر دارای LB آگار آمپی سیلین دار ریخته و کشت سه قسمتی می دهیم ، اجازه می دهیم کاملا جذب محیط شده و سپس آن ها را به مدت ۱۸ تا ۲۰ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه نگهداری می کنیم.
۳-۴-۳ ارزیابی کلونی ها
پس از انکوباسیون در ۳۷ درجه سانتیگراد اندازه کلونی ها به حدود ۱ تا ۲ میلی متر می رسد. یک تک کلونی را جدا کرده و در ۵ میلی لیتر LB براث آمپی سیلین دار تلقیح می نمائیم و به مدت یک شب در ۳۷ درجه و با سرعت مناسب شیکر انکوبه می نمائیم. با رشد باکتری در این محیط تایید می شود که باکتری ، پلاسمید حاوی ژن ما را دریافت کرده است.
۳-۴-۴ استخراج پلاسمیدAMP–pBSK حاوی DNACD166
اساس استخراج پلاسمید مبتنی بر لیز قلیایی و متعاقب آن جذب DNA توسط سیلیکا^[۴۱] و سپس جداسازی پلاسمید از ستون می باشد. برای استخراج پلاسمید از کیت تهیه شده از شرکت فرمنتاز لیتوانی استفاده شد (شکل ۳-۸).
شکل ۳-۸٫ کیت استخراج پلاسمید فرمنتاز
روش کار :
از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده که به مدت یک شبانه روز در دمای ۳۷ درجه انکوبه شده است و کاملا بصورت کدر درآمده است ، ۵/۱ میلی لیتر جدا کرده و داخل میکروتیوب ۵/۱ می ریزیم.