تترا متیل اتیلن دی آمین [ TEMED ] : 01/0 میلی لیتر
۲) ژل بالا یا ژل متراکم کننده^[۵۳]
H₂O استریل : ۴/۱ میلی لیتر
اکریل امید %۳۰ : ۴/۰ میلی لیتر
تریس ۵/۰ مولار ( ۸/۶ = PH ) : 6/0 میلی لیتر
SDS %10 : 05/0 میلی لیتر
آمونیوم پرسولفات [ APS ] %10 : 05/0 میلی لیتر
تترا متیل اتیلن دی آمین [ TEMED ] : 01/0 میلی لیتر
جهت تهیه بافر مخزن، ۳ گرم تریس، ۴/۱۴ گرم گلایسین و ۱ گرم SDS در یک لیتر آب مقطر حل شد. برای تهیه بافر نمونه^[۵۴] نیز ۱۰ میلی لیتر از بافر ژل متراکم کننده را با ۵ میلی لیتر گلایسین، ۱ گرم SDS ، ۲/۰ میلی لیتر محلول بروموفنول بلو و ۱ میلی لیتر ۲-مرکاپتواتانول در یک ظرف مخلوط کرده و سپس با آب مقطر به حجم ۲۰ میلی لیتر می رسانیم.

برای تهیه ژل ابتدا صفحات شیشه ای و اسپیسر ها را با آب مقطر و الکل تمیز می کنیم. اسپیسر ها را در کناره های جانبی دو شیشه قرار داده و با گیره به خوبی محکم می کنیم. ابتدا به آرامی محلول ژل پایین را
بین دو شیشه ریخته به طوری که حدود دو سانتیمتر از بالای شیشه را برای ریختن محلول ژل بالا خالی نگه داشته شود. بلافاصله بر روی ژل پائین آب مقطر یا ایزوبوتانل ریخته تا از مجاورت با اکسیژن هوا دور بماند و عمل پلیمریزه شدن به خوبی انجام گیرد. پس از حدود ۳۰ دقیقه که ژل پائین کاملا پلیمریزه شد، آب مقطر را با کاغذ صافی بطور کامل خشک می کنیم. بعد از آن محلول ژل بالا را افزوده و شانه را که از قبل با آب مقطر و الکل شسته شده است را در حد فاصل دو شیشه، درون محلول ژل بالا قرار می دهیم. پس از پلیمریزه شدن ژل بالایی، صفحات شیشه ای را درون بافر تانک قرار داده و شانه در درون بافر از ژل خارج می کنیم.
۳-۶-۲-۲ Run کردن نمونه ها
جهت Run کردن نمونه ها، ۱۵ میکرولیتر از مخلوط رسوب باکتری و اوره ۸ مولار را با ۵ میکرولیتر از بافر نمونه مخلوط کرده و به مدت ۵ دقیقه در بن ماری ۹۵ درجه سانتیگراد قرار می دهیم. ۲۰ میکرولیتر از مخلوط مورد نظر را در چاهک ژل ریخته و در ولتاژ اولیه ۱۲۰ ولت تا خارج شدن از ژل بالایی و ۱۶۰ ولت برای ژل پایینی الکتروفورز می کنیم. الکتروفورز تا زمانی ادامه پیدا می کند تا رنگ آبی کاملا به کناره پایینی ژل برسد.
۳-۶-۲-۳ رنگ آمیزی با کوماسی G-250 کلوئیدی
رنگ آمیزی با محلول کلوئیدی G-250 بر اساس روش بلاکسلی و بوئر با بعضی تغییرات انجام شد. با توجه به حالت کلوئیدی کوماسی در این روش زمینه ی ژل آنچنان رنگ نمی گیرد. حساسیت این روش بارها بیش از روش رنگ آمیزی با کوماسی R250 و در حدود ۲۰ تا ۳۰ نانوگرم پروتئین در هر باند است. در ضمن برای رنگ آمیزی پلی پپتید های کوچک روش مناسبی می باشد.جهت رنگ آمیزی از محلول های زیر استفاده شد :
۱) محلول ثبوت ( تری کلرو استیک اسید % ۲۰ ) : ۲۰ گرم تری کلرو استیک اسید را در آب مقطر حل کرده، حجم نهایی را به ۱۰۰ میلی لیتر می رسانیم.
۲) محلول رنگ آمیزی: ۴/۰ گرم کوماسی بلو G-250 را در ۲۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل می کنیم. سپس ۲۰۰ میلی لیتر محلول اسید سولفوریک ۱ مولار اضافه کرده، ۳ ساعت با همزن مغناطیسی هم می زنیم. محلول را با کاغذ صافی، صاف می کنیم. سپس به ترتیب ۴۵ میلی لیتر محلول هیدروکسید پتاسیم ۱۰ مولار و۶۰ میلی لیتر محلول تری کلرو استیک اسید خالص اضافه می کنیم. محلول را در دمای اتاق و به دور از نور می توان نگهداری کرد.
روش رنگ آمیزی به صورت زیر است:
۱) ژل را در یک ظرف شیشه ای یا پلاستیکی درب دار قرار می دهیم. مقدار کافی محلول ثبوت اضافه می کنیم و حداقل به مدت ۱ ساعت روی شیکر با حرکت آرام قرار می دهیم.
۲) محلول ثبوت را بطور کامل تخلیه می کنیم. مقدار کافی محلول رنگ آمیزی اضافه می کنیم و ظرف را به مدت ۳ ساعت در دمای ۴۵ تا ۵۰ درجه سانتیگراد یا به مدت ۱۲ ساعت در دمای اتاق روی شیکر با حرکت آرام قرار می دهیم.
۳) ژل را در به مدت ۱ تا ۲ ساعت با آب مقطر شستشو می دهیم تا زمینه شفاف گردد.
فصل چهارم : نتایج
۴-۱ نتایج حاصل از بهینه سازی توالی یا Optimization
در توالی نوکلئوتیدی اولیه پارامتر هایی وجود دارد که کارایی سیستم بیانی در میزبان E.coli را پایین می آورد. در نتیجه این پارامتر ها با جایگزینی نوکلئوتید های مناسب و ایجاد کدون هایی با راندمان بالا بهینه سازی شد. در تغییرات ایجاد شده نکات زیر مورد توجه قرار گرفت:
- هیچ اسید آمینه ای تغییر نکند.
- با توجه به دو قسمتی بودن پروتئین مورد نظر، تا حد امکان ساختار هر بخش پروتئینی در شکل نهایی تغییر ننماید.
- قالب خواندنی^[۵۵] در ژن نهایی تغییر نکند.
- کدون هایی انتخاب شود که بیشترین بیان را در میزبان داشته باشد.
- پایداری mRNA مورد بررسی و توجه قرار گیرد.
- جایگاه های آنزیم های محدود کننده در دو سر توالی بدون تغییر بماند.
پارامتر هایی که طی بهینه سازی دستخوش تغییر قرار گرفتند به شرح زیر می باشد :
) شاخص سازگاری کدون^[۵۶] یا ( CAI ) :
از لحاظ کمی مقدار تمایل کدونی، کدون های مترادف با بهره گرفتن از شاخص سازگاری کدونی یا CAI اندازه گیری می شود که بین صفر تا یک متغیر است. زمانی که این شاخص برابر صفر باشد به این معناست که همه کدون های مترادف به یک میزان در یک ژن استفاده شده اند و مقدار برابر یک به معنای حداکثر بودن میزان تمایل کدونی بوده و در این مورد فقط کدون های بهینه مورد استفاده قرار گرفته اند که بالطبع آن نشان دهنده بیان بیشتر و دائم یک ژن و به عبارتی تعیین کننده سطح بیان آن خواهد بود. با توجه به این پارامتر میزان CAI برابر با یک، بهترین حالت بیانی ممکن و بیشتر از ۸/۰ حالت بیانی خوب و ۶/۰ ، حالت بیانی متوسط را دارا خواهند بود. در توالی اولیه طراحی شده میزان CAI برابر با ۶۰/۰ بود که با تغییرات نوکلئوتیدی اعمال شده این میزان به ۸۸/۰ تغییر یافت. (شکل ۴-۲ )
شکل ۴-۱. شاخص سازگاری کدون. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی
بدین ترتیب میزان فراوانی کدون های بهینه^[۵۷] (FOP ) نیز افزایش یافت به صورتی که کدون های کاملا اپتیموم برای توالی آمینواسیدی در نظر گرفته شده از %۴۱ در توالی اولیه به %۶۹ در توالی بهینه شده افزایش یافتند. دیگر کدون ها هم در بهترین حالتی که در توالی می توانستند حضور یابند به صورت بهینه در آمدند. FOP اپتیموم نشان گر بیان کاملا دقیق کدون های کد کننده آمینو اسید ها هستند، بدین معنی که با توجه به میزان تغییراتی که در کل توالی می تواند صورت گیرد، برای یک آمینو اسید خاص، این کدون در میزبان بالاترین راندمان بیانی را می تواند داشته باشد. (شکل ۴-۲)
شکل ۴-۲. میزان فراوانی کدون های بهینه. سمت چپ: قبل از بهینه سازی، سمت راست: بعد از بهینه سازی
۲) شاخص محتوای G-C
میانگین محتوای G-C یک توالی مناسب بین %۳۰ تا %۷۰ ( بطور میانگین % ۵۰ ) می باشد. شاخص محتوای G-C توالی اولیه از میزان % ۵۵/۴۱ به % ۱۲/۵۱ در توالی بهینه سازی شده افزایش یافت که این امر موجب افزایش نیمه عمر mRNA ناحیه طراحی شده می شود. (شکل ۴-۳ )
شکل ۴-۳. شاخص محتوای G-C. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی.
با توجه به پارامتر های تغییر یافته، توالی ۴۲۲ نوکلئوتیدی نهایی برای ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM در شکل ۴-۴ نشان داده شده است. همچنین در شکل ۴-۶ نیز توالی اولیه و توالی بهینه سازی شده را بطور مقایسه ای و نوکلئوتید به نوکلئوتید می توان مشاهده کرد.
شکل ۴-۴. ترادف ناحیه C2مورد نظر پس از بهینه سازی کدون های مربوطه جهت بیان در میزبان E.coli .
شکل ۴-۵. مقایسه نوکلئوتید بصورت نظیر به نظیر در توالی های اولیه و بهینه سازی شده.
۴-۲ سنتز شیمیایی DNA ناحیه C2
توالی مورد نظر توسط شرکت Biomatik کانادا بصورت شیمیایی سنتز شد و درون وکتور pBSK قرار داده شد . این وکتور قبلا به نام pBMH شناخته می شد که طولی برابر با bp 2907 دارد. این وکتور دارای ژن مقاومت به آنتی بیوتیک آمپی سیلین می باشد که می توان از آن برای جداسازی کلونی های
نوترکیب استفاده کرد. طول توالی بعد از سنتز ژن به داخل پلاسمید به bp 3725 رسید. توالی سنتز شده تمام مراحل کنترلی کیفیت را با موفقیت گذارند. از جمله این مراحل می توان به موارد زیر اشاره کرد.
- تائید صحت توالی ژن نوترکیب
- تائید صحت توالی پلاسمید حامل
- تائید صحت شکل خواندن ( Reading Frame ) در فرایند رونویسی
- تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم آنزیمی ( شکل ۴-۶ )