برای تعیین مقدار کل ترکیبات فلاوونوئیدی از روش رنگ سنجی استفاده شد (Chang et al., 2002). جذب مخلوط آماده شده در طول موج ۴۱۵ نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتری خوانده شد. برای تعیین محتوای فلاوونوئید کل بر حسب میلی گرم در گرم نمونه از منحنی استاندارد کوئرسیتین استفاده شد.

۳-۳-۵-۳- قدرت مهار کنندگی رادیکال آزاد DPPH
فعالیت ضداکسایشی ترکیبات فرار گیاهی با روش افزودن هیدروژن یا توانایی جمع آوری رادیکال، با بهره گرفتن از رادیکال پایدار DPPH انجام شد ( Hatano et. al., 1998). DPPH یک رادیکال آزاد پایدار است که در حضور آنتی اکسیدان­ها در نمونه­های بیولوژیک به صورت زیر خنثی می شود:
DPPH + RH (DPPH – R)- H + R^.
رادیکال آزاد DPPH در محیط الکل اتانول باعث حداکثر جذب در ۵۱۷ نانومتر و ایجاد یک رنگ ارغوانی می­گردد. در صورت خنثی شدن این رادیکال، از شدت رنگ ارغوانی کاسته شده و به زرد کم رنگ تغییر می یابد، بنابراین کاهش جذب نوری متناسب با توانایی خنثی سازی رادیکال DPPH و به عبارت دیگر قدرت آنتی اکسیدانی نمونه مورد نظر خواهد بود. نتایج به صورت درصد مهار یا خنثی سازی رادیکال DPPH توسط نمونه مورد نظر بیان می شود.
۴۰ میکرولیتر از عصاره به لوله آزمایش منتقل شده و ۱ میلی لیتر از محلول ۲/۰ میلی مولار DPPH به آن اضافه شد. کاهش جذب در ۵۲۰ نانومتر بعد از ۳۰ دقیقه برای نمونه­ها خوانده شد. جذب رادیکال DPPH بدون عصاره بعنوان کنترل در نظر گرفته شد. درصد جمع آوری رادیکال مطابق فرمول ذیل محاسبه شد:
DPPH = درصد مهار =×۱۰۰
۳-۳-۵-۴- فعالیت ضد اکسایشی کل
به منظور ارزیابی فعالیت ضد اکسایشی کل عصاره­ها از روش ^[۸۹]FRAP استفاده شد (Benzie and Strain,1996). ۱۰ میکرولیتر از عصاره با ۳ میلی لیتر از معرف FRAP مخلوط و جذب مخلوط حاصل در ۵۹۵ نانومتر ارزیابی شد. غلظت­های مشخصی (۱۰ – ۶/۰ میکرومولار) از سولفات آهن (FeSO₄) جهت منحنی کالیبراسیون مورد استفاده قرار گرفت.
۳-۳-۵-۵- تعیین پایداری اکسیداتیوی
تعیین پایداری روغن­ها و چربی­ها در مقابل اکسیداسیون، به وسیله رنسیمت اندازه ­گیری شد که اولین بار توسط شرکت Metrohm و به وسیله پاردون و کرول در سال ۱۹۷۲ ارائه گردید. روش رنسیمت، بر اساس اندازه گیری محصولات حاصل از اکسیداسیون روغن­ها و چربی­ها است. زمان پایداری با بهره گرفتن از رنسیمت مدل Metrohm برای ۱۰ گرم نمونه روغن و در دمای ۱۱۰ درجه سانتی ­گراد اندازه گیری گردید. جریانی از هوا (h/1 20) از نمونه روغن مورد نظر که به دمای ۱۱۰ درجه سانتی ­گراد رسیده بود، عبور داده شد. گازهایی که در طول فرایند اکسید شدن همراه با هوا آزاد می شوند از یک ظرف حاوی آب دی یونیزه عبور داده شد. الکترود موجود در این ظرف، برای اندازه گیری هدایت ویژه تعبیه شده است. پایان زمان پایداری هنگامی است که هدایت ویژه نسبت به زمان شروع، افزایش سریع پیدا می کند. زمان پایداری روغن بر حسب ساعت در ۱۱۰ درجه سانتی ­گراد گزارش شد (تابعی و همکاران، ۲۰۰۸).
شکل ۳-۱- منحنی تعیین زمان پایداری روغن
۳-۴- طرح آزمایشات و آنالیز آماری
در مرحله اول ابتدا اثر چهار فاکتور عددی نظیر غلظت حلال در ۳ سطح (۴۰، ۵۰ و ۶۰ %)، پودر آب پنیر (۰، ۱۰ و ۲۰ g/100g)، دما (۴۵، ۵۵ و ۶۵ درجه سانتی ­گراد)، زمان (۱۶، ۲۴ و ۳۲ دقیقه) و یک فاکتور اسمی یعنی نوع حلال (اتانول و متانول) با بکارگیری طرح فاکتوریل و درجه تمایز^[۹۰] پنج مورد مطالعه قرار گرفتند.
در مرحله دوم این مطالعه اثر غلظت حلال در ۵ سطح (۳۷، ۴۰، ۴۳، ۴۶ و ۴۹%)، پودر آب پنیر (۱۰، ۲۰، ۳۰، ۴۰ و ۵۰g/100g)، دما (۵۵، ۵۸، ۶۱، ۶۴ و ۶۷ درجه سانتی ­گراد)، زمان (۲۴، ۲۶، ۲۸، ۳۰ و ۳۲ دقیقه) با بکارگیری روش سطح پاسخ، مدل درجه دوم به شاخص­ های مورد اندازه گیری برازش شد و نقاط بهینه با بکارگیری روش­های عددی و یا گرافیکی تعیین گردیدند. در این مرحله از تحقیق از طرح مرکب مرکزی با ۴ متغیر مستقل، ۵ سطح و ۶ تکرار در نقطه مرکزی طرح (به منظور بررسی تکرار پذیری طرح) استفاده گردید، تعداد کل تیمارها ۳۰ تیمار شد (جدول ۲). دما، زمان، غلظت حلال و میزان پودر آب پنیر متغیرهای مستقل و میزان ترکیبات پلی فنلی و فلاونوئیدها و قدرت مهارکنندگی رادیکال آزاد DPPH و فعالیت ضد اکسایشی کل (FRAP) متغیرهای وابسته بودند.
معادله بدست آمده از طرح مرکب مرکزی با بهره گرفتن از معادله چند جمله ای درجه دو چنین بود:
در این معادله پاسخ پیش بینی شده، β_۰ ثابت مدل، β_j ضریب خطی، X_i و X_j متغیرهای فاکتور در شکل کد شده، ijβ ضریب برهم کنش و _jjβ ضریب درجه دوم می­باشد.
مناسب بودن مدل از روی داده ­های عدم برازش مدل، ضریب تبیین (R² )، R²- adjusted و prediction R² forو F-value حاصل از جدول آنالیز واریانس بررسی شد. معنی داری مدل و متغیرهای آن در سطح احتمال ۰۱/۰ p< تعیین شد.
در مرحله سوم این مطالعه به منظور تأیید نتایج روش سطح پاسخ، عصاره در نقطه بهینه استخراج و تجزیه شد.
در مرحله چهارم این مطالعه عصاره استخراجی در ۳ سطح (ppm 200 ، ۴۰۰ و ۶۰۰) و آنتی اکسیدان سنتزی TBHQ در ۲ سطح (ppm 100و ۲۰۰) به نمونه روغن کره (روغن زرد) افزوده شدند و به وسیله رنسیمت پایداری روغن­ها و چربی­ها در مقابل اکسیداسیون اندازه گیری شد.
فصل چهارم
نتایج و بحث
۴-۱- نتایج مرحله اول
در سری اول آزمایشات اثر ۵ فاکتور میزان پودر آب پنیر (۰،۱۰ و ۲۰ گرم به ازای ۱۰۰ گرم نمونه)، دما (۴۵، ۵۵ و ۶۵ درجه سانتی ­گراد)، زمان (۱۶، ۲۴ و ۳۲ دقیقه)، نوع حلال (اتانول و متانول) و غلظت حلال (۴۰، ۵۰ و ۶۰%) بر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی و توان آنتی اکسیدانی عصاره های استخراج شده از پودر تفاله انگور تخمیر شده بررسی شد. نتایج آزمایشات مرحله اول به شرح جدول ۴-۱- می­باشد.
جدول ۴-۱- نتایج آزمایشات مرحله اول