Trise-base ، بوریک اسید و EDTA با مقادیر ذکر شده با آب مقطر به حجم cc 500 رسانده شد.

• • باید دقت شود که بافرهای با غلظت زیاد در حجم کم تهیه شود تا تحت تاثیر عوامل محیطی، بافر پایداری خود را از دست ندهد و رسوب نکند.

۳-۵-۲- محلول رنگ آمیزی DNA Stain
در اغلب آزمایشگاه‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ بیولوژی مولکولی از محلول اتیدیوم بروماید استفاده می‌‌‌‌‌‌‌‌شود. اتیدیوم بروماید یک ماده موتاژن قوی می‌‌‌‌‌‌‌‌باشد و در نتیجه در استفاده از آن باید توجه زیادی شود. بنابراین در این مطالعه از یک ماده جایگزین اتیدیوم بروماید استفاده شد. محلول DNA Stain یک ماده ایمن برای رنگ آمیزی نوکلئیک اسید می‌‌‌‌‌‌‌‌باشد که از لحاظ کارایی با اتیدیوم بروماید تفاوتی ندارد. برای استفاده از این ماده به ازای ۱۰۰ میلی لیتر ژل آگارز، µl 8-6 DNA Stain استفاده می‌‌‌‌‌‌‌‌شود.

۳-۶-استخراج DNA از خون
در این مطالعه برای استخراج DNA از کیت ATP استفاده شد که اساس آن روشSalting out – کلروفرم است. لازم است قبل از شروع کار، کلیه وسایل و مواد مورد نیاز ( میکروتیوپ ها، سمپلر و سر سمپلر، محلول‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ لیز کننده و…) روی میز کار قرار داده شود. دقت شود که اتانول در فریزر باشد تا موقع استفاده سرد باشد و کلیه وسایل اتوکلاو شده باشند.
به منظور استخراج DNA به ترتیب عمل شد:

1. 1. ۵۰۰ میکرولیتر از نمونه خون که در لوله‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ حاوی EDTA است، در ویال‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌۵/۱ یا ۲ میلی لیتری قرار داده شد.

1. 1. به نمونه خون، ۵۰۰ میکرولیتر بافر لیز کننده سلولی اضافه کرده و با سر و ته کردن ویال سعی شد سلول‌ها تخریب شوند. مجددا^ʺ ۱۰۰۰ میکرو لیتر بافر لیز کننده سلولی اضافه شد و با سر و ته کردن ویال یا ورتکس کردن لیز سلولی ادامه یافت‌‌.

1. 1. سپس مخلوط به دست آمده به مدت ۴ دقیقه با دور g7000 سانتریفیوژ شده و مایع رویی دور ریخته شد.

1. 1. مجددا^ʺ ۵۰۰ میکرولیتر بافر لیز کننده سلولی به رسوب اضافه شد‌‌‌‌‌ و مرحله دو و سه تکرار شد و سعی شد هر بار رسوب از ویال جدا شده و در بافر معلق شود و مرحله ۳ تکرار شد.

1. 1. سپس ۳۰۰ میکرولیتر بافر لیز کننده هسته‌ای به رسوب اضافه شده و ویال‌‌ها به مدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق قرار داده شد.

1. 1. پس از آن ۱۰۰ میکرولیتر NaCl 6M و ۶۰۰ میکرولیتر کلروفرم به ویال اضافه کرده و مخلوط شد.

1. 1. سپس ویال‌‌ها را حدود ۱۵ ثانیه ورتکس کرده تا محلول همگنی به دست آید.

1. 1. سپس ویال‌ها به مدت ۴ دقیقه با دور g 7000 سانتریفیوژ گردید که در این مرحله ۳ فاز دیده شد که فاز رویی حاوی DNA است.

1. 1. با دقت ۳۰۰ میکرولیتر از محلول رویی را در تیوب جدید ریخته‌‌‌‌‌‌ و فازهای دیگر دور ریخته شد. ( این مرحله باید با دقت انجام شود تا از فاز‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ دیگر بر داشته نشود).

1. 1. ۱۰۰۰ میکرولیتر اتانول ۱۰۰% سرد (که قبلا در ۲۰- درجه سانتی‌گراد قرار داده شده‌است) به ویال اضافه شده و به آهستگی سروته شده تا کلاف DNA مشاهده شود (گاهی اوقات ممکن است کلاف دیده نشود).

1. 1. سپس به مدت ۲ دقیقه دورg 10000 سانتریفیوژ شد.

1. 1. محلول رویی دور ریخته شده و ۷۰۰ میکرولیتر اتانول ۷۰% سرد برای شستشوی DNA اضافه شده و آهسته تکان داده شد و مرحله ۱۱ مجددا تکرار گردید‌‌‌.

1. 1. محلول رویی دور ریخته شد و میکروتیوب‌ها به صورت وارونه روی یک دستمال قرار داده ‌‌‌‌شدند تا خشک شوند و الکل تبخیر شود. حدودا^“ ۳۰ دقیقه کافی است.

1. 1. در نهایت حدود ۱۰۰-۵۰ میکرولیتر آب دو بار تقطیر استریل به میکروتیوب ها اضافه گردید، در این مرحله می‌‌‌‌‌‌‌‌توان به جای آب از بافر (Trise-EDTA)TE نیز استفاده کرد و DNA استخراج شده در دمای ۴ درجه سانتی نگهداری می‌‌‌‌شود.

۳-۷- تهیه ژل آگارز و الکتروفورز
بسته به درصد ژل آگارز مورد نیاز، ژل تهیه می‌‌‌‌‌‌‌‌گردد که برای تهیه cc20 ژل آگارز ۲% به ترتیب زیر عمل شد:

1. 1. ۳/۰ گرم پودر آگارز در یک ارلن ریخته و با ۲۰ میلی لیتر بافر TBE1X مخلوط کرده و با بهره گرفتن از دستگاه ماکروویو حرارت داده شد، تا شفاف شود.

1. 1. سپس به آن مقدار µl 2/1 DNA Stain افزوده شد.

1. 1. در مرحله بعد ژل در سینی حاوی شانه ریخته شد. پس از سفت شدن ژل، شانه به آرامی برداشته شده و سینی داخل تانک حاوی بافر قرار داده شد. لازم به ذکر است که بایستی بافر چند میلی‌متر روی سطح ژل را بپوشاند.

1. 1. محصول PCR یا DNA تام استخراج شده با بافر سنگین کننده (۶X) (به اندازه ی ۲/۰ حجم محصول PCR یا DNA تام)، مخلوط شده و به درون چاهک انتقال داده شد.

1. 1. جریان در دستگاه با ولتاژ ۱۴۰ ولت برقرار شد.

1. 1. پس از اینکه رنگ پیشرو دو سوم طول ژل را طی کرد، ولتاژ قطع گردید و ژل از درون تانک خارج شد و سپس با بهره گرفتن از دستگاهGel documentation عکس برداری انجام گرفت.

۳-۸- طراحی پرایمر
برای مشخص کردن SNP‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ ناحیه پروموتری ژن GKN1، ابتدا با نرم افزار oligo، پرایمر‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ اختصاصی مورد نظر طراحی گردید و با بهره گرفتن از سایت Pubmed توالی پرایمرها BLAST گردید تا اختصاصیت آن‌ها مورد بررسی قرار گیرد و پرایمرها توسط شرکت ماکروژن کره با واسطه شرکت زیست پیشگام ایران سنتز شد.
۳-۹- تکثیر ناحیه پروموتری ژن GKN1
پس از طراحی پرایمرهای مناسب، دو ناحیه از پروموتر ژن GKN1 به نام‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ فرضی GKN1A و GKN1B با تکنیک PCR تکثیر شد. توالی پرایمرها، شرایط PCR و مواد مورد نیاز PCR به ترتیب در جدول ۳-۱، ۳-۲ و ۳-۳ آمده است.
جدول ۳-۱: توالی پرایمرهای GKN1A و GKN1B