- سانتریفیوژ با دور rpm[136]­۵۰۰۰­­ به مدّت min5 و دور ریختن محلول روئی که حاوی Extender بود( به دلیل سفت نبودن رسوب ، با سمپلر محلول روئی به آرامی کشیده­شد).
۳-۲-۲-۲-۲- پروتئین­زدایی
۳-۲-۲-۲-۲-۱- ساخت محلول­Lysis Buffer (c ◦۶۰ )
جدول(۳-۳):موادتشکیل دهنده محلول Lysis Buffer

 

نام ماده مقدار مورد نیاز
مرکاپتواتانول ml 2
TrismM­۱۰ (PH=8) g121/0
NaCl g58/0
[۱۳۷]EDTAmM­۱۰ (PH=8) g 292/0
SDS[138] ۱% g 5/0

۳-۲-۲-۲-۲-۲-رسوب دادن پروتئین­ها
اضافهکردن lµ۴۵۰ از محلول LB(c◦۶۰ )،lµ۵۰ از محلول DTT( M 5/0 ) و lµ۱۰ از آنزیم پروتئیناز K(1- mg.ml20 ) به ویال­های حاوی رسوب سلول­های اسپرم و ورتکس با دستگاه Micro Spin .
قرار دادن ویال­ها به مدّتh3 روی دستگاه ترمومیکسر با دمای c◦۶۰ و لرزش S20 به ازای هرmin 1 و دور لرزش rpm600 .
ورتکس و اسپین نمونه­ها پس از اتمام زمان ترمومیکسر .
اضافه کردنlµ ۱۶۰ از محلول NaCl اشباع و تکان دادن شدید ویال­ها با دست به صورت دورانیبه مدّتmin 2 جهت تسهیل جداسازی پروتئین­ها .
سانتریفیوژ به مدّتmin 10 با دور rpm 13000و ریختن محلول رویی در ویال­های جدید دارای برچسب و نام­گذاری.
۳-۲-۲-۲-۳- جداسازی DNA
میزان اضافه کردنml­۱ اتانول مطلق و سرد به محلول هر ویال و به آرامی تکان دادنو آشکار شدن کلاف DNA و قرار دادن ویال­ها به مدّت min20 در فریزرc ◦۲۰-.
سانتریفیوژ به مدّت min10 با دورrpm 12000 شد و دور ریختن اتانول و جداسازی رسوبDNA .
حل کردن رسوب DNA هر ویال در lµ۸۵ آب فاقد یون[۱۳۹]با عمل پیپتاژِ خیلی آرام و نگه­داری در دمای c◦۴.
۳-۲-۲-۲-۴- تعیین غلظت و خلوص DNA استخراج­شده
برای ارزیابی غلظت و خلوص DNA،از دو روش استفاده شد:
مقاله - پروژه
۳-۲-۲-۲-۴-۱- استفاده از ژل آگارز
در این روش نمونه­های DNAبا غلظت­های متفاوت روی ژل آگارز ۱% الکتروفورز شد.ژل به­وسیله اتیدیوم­بروماید رنگ­آمیزی شده و تحت نور ماوراء بنفش بررسی گردید.مقدار و کیفیت DNA از روی قطر و جایگاه قرارگیری باند مشخّص شد.
۳-۲-۲-۲-۴-۱-۱- مواد و لوازم
پودر آگارز
بافرTBE [۱۴۰]X )5/0 (
لوازم الکتروفورز (شانه و سینی مخصوص ، تانک الکتروفورز ، دستگاه مولد نیرو )
رنگ بافر بارگزاری[۱۴۱]
سمپلر و سر سمپلر µl 100-10

موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...