۱_۲_۲ فیزیولوژی اسپرم سگ و نحوه آنالیز اسپرم
فیزیولوژِی تولید مثل دام نر شامل تولید اسپرم، انتقال و ورود آن به دستگاه تولید مثل ماده و باروری تخمک می باشد. هر گونه اختلالی در این روند فیزیکی، شیمیایی و بیولوژی می تواند روی باروری تاثیر بگذارد .
اسپرم سازی به وسیله محور هیپوتالاموس–هیپوفیز-بیضه کنترل می شود.
بخشهای لوله ای دستگاه تولید مثل نر شامل اپیدیدیم، وازدفران، میزراه، پروستات و قضیب مسئول بلوغ، ذخیره و انتقال اسپرماتوزوا و مایع منی به دستگاه ماده در طول دوره فحلی می باشد.
بیضه ها در قسمت عقبی شکمی اسکروتوم و خارج از شکم قرار دارد. خارج قرار گرفتن بیضه ها از شکم برای تنظیم دمای بیضه الزامی است، پروسه اسپرم سازی به دمای بالای داخلی بدن حساس است همچنین درجه حرارت به وسیله انتقال گرما بین سرخرگ و سیاهرگ بیضه در محل شبکه عروقی پیچک مانند،کنترل می شود. فعایت غده عرق اسکروتوم، نازکی پوست و مهم تر از همه تغییر موقعیت بیضه ها نسبت به بدن به وسیله ماهیچه کریمستر در تنظیم درجه حرارت نقش دارد.(جانسون،۲۰۰۱)

بیضه ها دارای سه نوع سلول هستند که مسئول تولید اسپرم است: اسپرماتوگونیا، سرتولی و سلول های لیدیگ. سلول های سرتولی و لیدیگ تحت کنترل محور هورمونی هیپوتالاموس-هیپوفیز-بیضه است. هورمون GnRH از هیپوتالاموس آزاد می شود، که این هورمون باعث تحریک ترشح هورمون لوتئینی کننده و هورمون تحریک کننده رشد فولیکول از هیپوفیز می شود. هورمون روی سلول های لیدیگ و سرتولی تاثیر می گذارد، باعث تحریک تولید تستسترون از سلول های لیدیگ و ساخت پروتئین باند شونده به اندروژن و تبدیل تستسترون به استروژن در سلول های سرتولی می شود.(نوکاس،۲۰۰۱)
تستسترون که به گردش خون محیطی آزاد می شود به وسیله احیا کننده ی ۵-آلفا در بافت های مختلف مثل پروستات و فولیکول مو به دی هیدرو تستسترون تبدیل می شود و مسئول بروز بسیاری از صفات ثانویه جنسی بخصوص در زمان جنینی می باشد.(جانسون و نوکاس،۲۰۰۱)
بازخورد منفی روی گنادوتروفین ها به وسیله تاثیر مستقیم تستسترون و استروژن روی هیپوتالاموس ایجاد می شود. اینهیبین هورمون دیگری است که توسط سلول سرتولی تولید می شود و به وسیله بازخورد منفی روی هیپوفیز از آزاد سازی FSH جلوگیری می کند.(نوکاس،۲۰۰۱) سلول های سرتولی مسئول حمایت از اسپرماتوزوا هستند، به طوری که مواد غذایی ضروری را تامین می کند و همچنین سلول های هاپلویید از حمله دستگاه ایمنی حفظ می کند. این سد دفاعی، به نام سد خونی-بیضوی برای زنده ماندن و مراحل پیشرفت اسپرماتوزوا ضروری است.(راسل و همکاران۱۹۸۰،وکامبروسیو،۲۰۰۳)
تستسترون مسئول چسبندگی بین اسپرماتوسیت های بالغ و سلول های سرتولی است .(چنگ،۲۰۱۰)
سلول های لیدیگ که با نام سلول های بینابینی نیز شناخته می شوند، از سلول های سرتولی و اسپرماتوگونیا به وسیله غشاء پایه جدا شده اند و توسط بافت پیوندی، لنفاوی و عروقی خونی که ارتباط بسته ای دارند حمایت می شود.(جانسون،۲۰۰۳)
سلول های لیدیگ بافت پیوندی و عروقی قسمتی از بافت بینابینی پارانشیم بیضه است،همانطور که گفته شد از سلول های سرتولی و زایا به وسیله غشاء پایه جدا می شود. اپیتلیوم سمینی فرها، در سمت مخالف غشا پایه قرار دارند و به سه بخش تقسیم می شوند: پایه، عمقی و سطحی.اهمیت این بخش ها در گسترش بیشتر قسمت های اسپرم سازی است. اپیتلیوم سمینی فرها شبکه ای از لوله های به هم پیچیده را تشکیل می دهد که به لوله های وسط بیضه وصل می شوند و ساختمان ماکروسکوپی که مدیاسیتینوم نامیده می شود را تشکیل می دهد.(جانسون،۲۰۰۳) این قسمت، محل اصلی جمع شدن اسپرماتوزوا در بیضه قبل از انتقال به لوله های آوران و به سر اپیدیدیم است.در این جا آخرین مرحله شکل گیری اسپرماتوزوا اتفاق می افتد.
۲_۲_۲ اسپرم سازی
تبدیل سلول های زایا اولیه به اسپرماتوزوا است که قابلیت باروری تخمک را دارند. این پروسه به چندین مرحله تقسیم می شود: میتوز، میوز، اسپرمیوژنر.(هس و همکاران،۲۰۰۸ و ونگ و همکاران،۲۰۰۹)
در طول میتوز سلول های ابتدایی نوع اسپرماتوگونیا A تقسیم و ذخیره سازی می شود به این وسیله بر مرگ سلولی ناشی از مواد طبیعی غلبه می کنند. بنابرین سلولهای اولیه زایا برای تولید اسپرم در طول زندگی وجود دارند. بعضی از سلول های نوع A برای تولید تستسترون انتخاب می شوند. نوع B اسپرماتوگونیا به میتوز خود ادامه می دهند و در آخرین میتوز تبدیل به اسپرماتوسیت اولیه می شوند.(هس و همکاران،۲۰۰۸)
تقسیم میوز در مرحله لپتوتن شروع می شود و در این زمان اسپرماتوسیت به سد خونی بیضه ای یا محل اتصال سلول های سر تولی متصل می شود از قسمت های عمقی اپیتلیوم سمینی فرها عبور می کند.(نوکاس،۲۰۰۱ و هس و همکاران،۲۰۰۸)
میوز۱ شبیه به میتوز یک اسپرماتوسیت ثانویه دیپلویید تولید می کند و میوز ۲ که در پشت سد خونی بیضه ای اتفاق می افتد اسپرماتوسیت هاپلویید که اکنون از سلول های دیگر بدن از نظر آنتی ژنی متفاوت است تولید می کند. به این ترتیب ۴ سلول اسپرماتید از یک سلول اسپرماتوسیت اولیه تولید می شود.
اسپرم سازی به ۴ مرحله تقسیم می شود: گلژی، ظرفیت پذیری، اکروزومال و بلوغ. در فاز گلژی، لوله های گلژی آنزیم های ضروری برای بلوغ سیستم اکروزوم را تولید می کنند و موقعیت آن را در بالای هسته اسپرم مشخص می شود.(هس و همکاران،۲۰۰۸) مرحله بعدی، ظرفیت پذیری است، در این مرحله اکروزوم با هسته تماس پیدا می کند و یک سوم طول هسته را می پوشاند. در ادامه فاز اکروزومال، که مهاجرت سیستم اکروزومال به سطح شکمی اسپرماتید است. آخرین مرحله اسپرم سازی، نازک شدن اکروزوم و مهاجرت است که قسمت بیشتر هسته را می پوشاند جمع شدن هسته ادامه پیدا می کند و سیتوپلاسم زیادی توسط سلول های سرتولی فاگوسیت می شود. همچنین در این مرحله سانترول ها در طول دم قرار می گیرند.(هس و همکاران،۲۰۰۸)
زمان اسپرم سازی بستگی به سلول ها و یا مرحله چرخه اسپرم سازی دارد. از آنجایی که سلول های سرتولی مراحل مختلف اسپرماتوسیت را دارند، الگوی پیشرفت سلولی با توجه به مرحله سلولی شناخته می شوند.
در سگ، یک چرخه سلولی شامل ۸ مرحله است و ۶/۱۳ روز به طول می انجامد.(راسل و همکاران،۱۹۸۰ و فوت،۱۹۷۲) کل طول فرایند اسپرم سازی ۲/۶۱ روز و معادل ۵/۴ سیکل است. آخرین مرحله بلوغ اسپرم در اپیدیدیم تحت کنترل اندروژن اتفاق می افتد. در اپیدیدیم با تولید گلیکوپروتئین و پپتید،اسپرم توانایی حرکت و لقاح پیدا می کند. در سگ این پروسه تقریبا ۱۰ روز به طول می انجامد.(اولار،۱۹۸۳)
هنگام عبور اسپرم از سر به دم اپیدیدیم، باقی مانده سیتوپلاسم از قسمت بالا به پایین دم می آید که این آخرین مرحله بلوغ است.
۳_۲_۲ فاکتور های موثر در کیفیت اسپرم
فاکتور های زیادی روی کیفیت اسپرم سگ سالم تاثیر گذار هستند که شامل میزان خلوص نژاد سگ، سن، نژاد، روش و دفعات جمع آوری اسپرم می باشد.
مطالعات انجام شده نشان می دهد که ژنتیک روی کیفیت اسپرم تاثیر گذار است. همچنین کیفیت اسپرم در سگ های جوان (کمتر از ۱ سال) به دلیل بلوغ جنسی و در سگ های پیر به دلیل تغییرات دژنرسانس (نئوپلازی اسپرم و کاهش تولید تستسترون در بیضه ) پایین تر است.(جیم و همکاران،۱۹۷۹ و لوست،۱۹۹۰)
نژاد روی کیفیت اسپرم تاثیر گذار است و بیشتر بر روی میزان کل اسپرم تاثیر گذار می باشد. از جمله تفاوت های نژادی، اندازه بیضه است، یعنی سگ بزرگتر بیضه بزرگتر دارد و اسپرم بیشتری تولید می کند. در صورت نبودن سگ ماده فحل و ناآشنا و استرس زا بودن محیط، کاهش میل جنسی و کاهش کیفیت اسپرم رخ می دهد.(اولار،۱۹۸۳)
بر اساس دفعات جمع آوری اسپرم نشان داده شده است بهترین کیفیت اسپرم زمانی است که اسپرم گیری یک بار در ۲ تا ۵ روز انجام شود.کاهش حرکت اسپرم و کاهش اسپرم های با شکل طبیعی به دلیل پیر شدن سلول ها بروز می کند.(بوچر،۱۹۸۵)
۱-۳-۲ ریتم های روزانه و فصلی
برخی از رفتاهای بیولوژی گواه بر این مدعاست که شرایط آب و هوایی و تغییرات دوره‌ای مثل روز و شب، تغییرات ماهانه و فصلی و تغییرات سالیانه می‌تواند بر روی برخی رفتارهای فیزیولوژیک بدن از جمله خواب، رفتارهای تولید مثلی تاثیرگذار باشد.
ملاتونین محصول ترشح غده پینه آل است. شواهد حاکی از آن است که مهمترین نقش ملاتونین انتقال اطلاعات محیطی از جمله ریتم روز و شب به بدن است (۱۴-۱).
ریتم روز وشب و همچنین ریتم‌های فصلی در گونه‌‌های مختلف می‌تواند تاثیر بسزایی بر روی بروز رفتار تولید مثلی در دو جنس نر و بخصوص ماده داشته باشد.
تولید اسپرم در تمام طول سال در بدن بالغ جریان دارد اگرچه کیفیت اسپرم و تمایل جنسی در حیوان نر دستخوش تغییرات فصلی و شبانه روزی می‌باشد (mac).
۲-۳-۲ عملکرد ملاتونین
کشف ملاتوین توسط لرنر و همکاران در سال ۱۹۵۸ شاخه جدیدی از تحقیقات را در زمینه فیزیولوژی تولید مثل ایجاد کرد )لرنر و همکاران، ۱۹۵۸).
اگرچه هافر ۷۰ سال قبل از تشخیص ملاتونین اعلام کرد که تومور غده پینه آل فعالیت‌های تولید مثلی زمان بلوغ را دگرگون می سازد (هوبنر،۱۸۹۸). در آن زمان حدس زده می‌شد بعضی از فاکتورهای با منبع پینه آل توانایی تأثیر بر رفتارهای تولید مثلی دارد (هوبنر، ۱۸۹۸).
این اکتشافات منجر به این شد که در نیمه اول قرن ۲۰ دانشمندان زیادی به معاینه و بررسی علمی همکاری پینه آل و رفتارهای تولید مثلی در گونه‌های مختلف بپردازند اما مشاهدات چندان دقیق و کاربردی حاصل نشد (کیتای و همکاران،۱۹۵۴؛تیبلوت و همکاران،۱۹۵۵). پس از آن مطالعات سلولی در زمینه ی ملاتونین و غده ی پینه آل مشخص کرد که فعالیت‌های متابولیک این غده در هنگام شب افزایش پیدا می‌کند (کووی، ۱۹۵۶؛ موگلر، ۱۹۵۸).
این مشاهدات خیلی زود توسط تحقیق دیگری که ادعا می‌کرد فعالیت یکی از آنزیم‌هایی که برای تولید ملاتوتین مورد نیاز است (Hydroxyindol O_Methyltransferase) که امروزه (acetylserotonin O_methyltransferas) نامیده می‌شود در طول شب بالاتر است به اثبات رسید (اکسلرود و همکاران، ۱۹۶۴).
با توجه به در دسترس بودن ملاتونین تجاری و همچنین دانشی که احتمالا غده پینه آل شب‌ها بیشتر تحریک می‌شود دانشمندان توانستند مطالعات و معاینات بیشتری را در زمینه پتانسیل ارتباط این غده با بیولوژی تولید مثل طراحی کنند. این مطالعات نوین به زودی آشکار کرد که مواجهه یک جونده حساس به نور به روزهای کوتاه سال (هافمن و همکاران۱۹۶۵) و یا تزریق روزانه ملاتونین به رت ها (چو و همکاران،۱۹۶۴) فعالیت محور هیپوفیز-گنادها را عوض کرد و همچنین حقانیت فرضیه ارتباط غده پینه آل به معنای یک غده درون ریز با چرخه رفتارهای تولید مثلی مخصوصاً در تولید مثل‌های فصلی را به اثبات رساند (ریتر و همکاران، ۱۹۶۶).
حیوانات با روند تولید مثل روز بلند از لحاظ جنسی در ماه‌های زمستان فعالیت کمی دارند. چون که کاهش فعالیت تولید مثلی در ارتباط نزدیکی با افزایش سطح ملاتونین می‌باشد می‌توان ملاتونین را antigonadal یا antigonadotrophic نامید (ریتر و همکاران،۱۹۷۳). می توان با برداشتن نمونه غده ی پینه آل از بروز سکون تولید مثلی جلوگیری کرد (استتسون و همکاران ۱۹۷۵).
حیوانات با روند تولید مثلی روز کوتاه در روزهای کوتاه سال از لحاظ جنسی دارای بیشترین فعالیت خود می باشند زمانیکه سطوح ملاتونین در بیشترین حد دوره‌های شبانه می‌باشد در این گونه‌ها می‌توان ملاتونین را progonadotrophic نامید (کولهو و همکاران ۲۰۰۶؛ واگنر و همکاران ۲۰۰۸؛ چمینو و همکاران ۲۰۰۸)
مشخصا ملاتونین به خودی خود نه antigonadotrophic است و نه progonadotrophic. بلکه تغییرات دوره شبانه روزی ترشح ملاتونین یک سیگنال غیر فعال است که اطلاعاتی را بر حسب زمان‌های مختلف سال برای محور هیپوتالاموس-هیپونیز-گناد محیا می‌کند (ریتر، ۱۹۷۳).
در حیوانات روز کوتاه محور تولید مثل مشخصا از ریتم‌های ملاتونین وابسته به فصل برای تنظیم فیزیولوژی تخم‌دان‌ها و بیضه‌ها استفاده می‌کنند. در این الگو توانایی انجام موفق جفت گیری در زمان هایی از سال را وجود دارد که بر اساس مدت زمان آبستنی و اینکه متولدین دسترسی مناسب به دمای محیط مناسب و غذا را داشته باشند اطمینان حاصل کند (ریتر، ۱۹۸۰).
برای توضیح بیشتر اهمیت تاثیر طول روز بر توانایی تولید مثل، در تولید مثل‌های فصلی به اثبات رسیده است که تمام دوره شبانه افزایش ملاتونین یک اصل برای ایجاد یا عدم رفتارهای تولید مثلی می‌باشد (الیوت، ۱۹۷۶؛ کارتر و همکاران، ۱۹۸۳؛ ریتر ۱۹۸۰).
به صورت تئوری پذیرفته شده است که تغییرات گنادها در پستانداران با تولید مثل وابسته به فصل چه روز بلند‌ها و چه روز کوتاه‌ها، وابسته به نوسانات سالانه در طول روز و شب می‌باشند که تایید کننده مدت زمان بین افزایش مقدار ترشحات شبانه ملاتونین می‌باشد (شکل ۱، برت و همکاران، ۲۰۰۳؛ لینکلن، ۲۰۰۶؛ دوپر و همکاران، ۲۰۰۸) .
۳-۳-۲ مکانیسم تولید ملاتونین
گیرنده‌های نور که واسطه رفتارهای تولید مثلی وابسته به نور هستند به صورت سلول گنگلیون شبکیه کاملاً تخصصی می‌باشند که شامل یک رنگدانه وابسته به نور خاص به نام melanopsin می‌باشد (پاندا و همکاران، ۲۰۰۵؛ کیو و همکاران، ۲۰۰۵).
این سلول‌های عصبی اطلاعات مربوط به طول روز و شب را توسط تنه retinohypothalamin به ساعت بیولوژیک بدن (supra chiasmatic nuclei (SCN)) در جلوی هیپوتالاموس منتقل می کند (مور و همکاران، ۱۹۹۵؛ هاتر و همکاران، ۲۰۰۲). SCN این اطلاعات را توسط نورون‌های سمپیاتیک مرکزی و محیطی به غده‌ی پینه آل منتقل می‌کند (کاپرز، ۱۹۷۶؛ مور، ۱۹۷۸).
فیبر های عصبی پس گانگلیونی با اعصاب مهار کننده ی غده پینه آل سیناپس برقرار می کند.این فیبر های عصبی باعث مهار ترشح pinealocyte ها توسط غده ی پینه آل می شوند که باغث جلو گیری از سنتز ملاتونین می شود.در شب با کاهش نور و با کاهش ارسال سیگنال های شبکیه و کاهش مهار pinealocyte ها توسط post gangelionic SCN ملاتونین تولید و ترشح می شود.ملاتونین تحریک تولید و ترشح GnRH را توسط هیپوتالاموس که منجر به ترشح LH از غده هیپوفیز می شود را بر عهده دارد.فرکانس زیاد و دامنه ی کم پالس های LH منجر به فعالیت های تولید مثلی میشود و فرکانس کم و دامنه ی زیاد ترشح LH باعث غیر فعال کردن گناد ها و anoestrus می شود (ریتر، ۱۹۹۱).

اگر اعمال اعصاب سمپاتیک در قبال غده پینه آل از بین برود به وسیله bilateral supperiorcervical gangeliectomy ترشحات شبانه ملاتونین اتفاق نمی‌افتد و این غده دیگر توانایی تنظیم فیزیولوژی تولید مثلی را ندارد (ریتر و همکاران، ۱۹۶۶).
بنابراین این گروه از حیوانات توانایی تولید مثل دائم را پیدا می‌کنند وضعیتی که موجب آسیب جدی حیواناتی می‌شود که در شرایط متفاوت آب و هوایی زندگی می‌کند.
مکانیسم ‌های سلولی و مولکولی هستند که به وسیله آنها ملاتونین بر سطح محور نورو اندوکراین نظارت می‌کند تا بتواند ترشح گنادوتروپین های هیپوفیز و پرولاکتین را از به هم ریختگی درآورد (مورگان و همکاران، ۲۰۰۸؛ گیلوم و همکاران، ۲۰۰۸؛ داردنت، ۲۰۰۸). که شامل گیرنده های سلولی هستند که تاثیرات ملاتونین را متناسب می‌کند (رپرت، ۱۹۹۷؛ دونکان، ۲۰۰۷؛ رول، ۲۰۰۷).
چیزی که مشخص است این است که فعالیت ملاتونین در چندین سطح انجام می‌شود که شامل hypothalamic، adenohypophyseal ، و انتهای ارگان ها می‌باشد.
تحقیقاتی که در آنها هم از روز کوتاه‌ها و هم از روزبلند‌ها استفاده شده کمک بسیاری می‌کند تا به وسیله آنها بفهمیم مکانیسم اثر ملاتونین و طول روز برای تولید مثل فعلی چگونه است. به عنوان نتیجه این یافته ها ملاتونین به عنوان یک ماده دارویی برای جلو انداختن تولید مثل گوسفند و ایجاد سیکل استروس و افزایش بره زایی در دوره‌های آن استروس طبیعی گوسفندها به صورت موفق مورد استفاده قرار گرفت (هارسن، ۱۹۹۲؛ ابسیا، ۲۰۰۷).