TEMED

۶۵۰ میکرو لیتر
۲/۷۰ میکرو لیتر

ابتدا محلول اکریل آمید ۳۰ درصد را درون مزور ریخته، سپس TBE (x1) را اضافه و محلول به حجم ۶۵ میلی‌لیتر رسانده شد. پس از هم زدن و یک نواخت کردن محلول به صورت هم زمان محلول TEMED و APS 10 درصد اضافه کرده و به سرعت محلول را مخلوط نمودیم. سپس محلول آماده شده را با دقت داخل شیشه مخصوص تانک عمودی الکتروفورز ریخته و سپس شانه مخصوص را داخل شیشه و روی ژل قرار دادیم. این نکته لازم به یاد آوری است که در هنگام گذاشتن شانه روی ژل باید از به وجود آمدن حباب جلوگیری کرد. زیرا مانعی جهت حرکت باندها در خلال الکتروفورز بوده و باعث می‌شود که باندها در داخل ژل به خوبی حرکت نکنند. همچنین در هنگام ریختن ژل درون شیشه‌ها باید به این نکته مهم توجه کرد که مواد به صورت یکنواخت حل شده باشند، در صورت عدم یکنواخت بودن محلول باعث کمانی شدن روند حرکت باندها روی ژل می‌شود.
۳-۸-۲ آماده سازی دستگاه الکتروفورز عمودی
در این پژوهش از دستگاه الکتروفورز عمودی مدل VSTA-1002M استفاده شد. قطر ژل در این تحقیق ۲ میلی‌متر و ابعاد ژل ۳۵×۲۵ بوده است. هنگام استفاده از این نوع ژل بایستی شیشه‌های مخصوص آن کاملا با آب شسته و به الکل آغشته و سپس با یک دستمال عاری از هرگونه کرک و آلودگی خشک گردد. فضا سازها^[۵۶] را آغشته به وازلین کرده و روی شیشه زیرین قرار داده و سپس شیشه رویی نیز روی فضا سازها و شیشه زیرین قرار می‌گیرد. برای اینکه دو شیشه به همراه فضا سازها خوب به همدیگر بچسبند از گیره‌های مخصوص استفاده می‌شود. پس از تزریق محلول ژل به داخل شیشه‌ها مدتی صبر کرده تا ژل درون شیشه جامد شده و سپس شیشه را در یخچال قرار داده تا ژل خنک شود (تا چاهک‌ها به‌خوبی شکل بگیرند). ولتاژ دستگاه برای هر دو جایگاه بر روی ۴۰۰ ولت تنظیم شد که به مدت ۲۲ ساعت به طول انجامید.

۳-۸-۳ رنگ آمیزی با نیترات نقره
رنگ­ آمیزی محصولات SSCP ژن GH با نیترات نقره انجام شد. در این روش باندها با وضوح بیشتری قابل مشاهده هستند. رنگ _­آمیزی نیترات نقره حساسیت بیشتری نسبت به رنگ­ آمیزی ژل آگارز (اتیدیوم بروماید) دارد، علاوه بر این ژل اکریل آمید مدت طولانی‌تری قابل نگهداری است.
۳-۸-۳-۱ مراحل انجام رنگ آمیزی نیترات نقره:
بعد از تمام شدن الکتروفورز عمودی، بافر تانک تخلیه شده و گیره‌ها باز می‌شوند و سپس شیشه از دستگاه جدا می‌شود. سپس شیشه‌ها روی یک سطح صاف قرار داده و به آرامی از هم جدا گردد.
برای رنگ­ آمیزی ژل ­اکریل ­آمید از سه محلول استفاده شده که عبارتند از:
محلول ثابت کننده^[۵۷]
جدول ۳- ۸ مواد لازم جهت تهیه محلول ثابت کننده

مواد استفاده شده

مقدار مواد

آب مقطر
اتانول (۹۶ درصد)
اسید استیک (۱۰ درصد)

۳۶۰ میلی لیتر
۴۰ میلی لیتر
۲۰۰۰ میکرو لیتر

محلول رنگ ­آمیزی^[۵۸]
جدول ۳-۹ مواد لازم جهت تهیه محلول رنگ‌آمیزی

مواد استفاده شده

مقدار مواد

آب مقطر

۲۰۰ میلی لیتر

نیترات نقره

۲/۰ گرم