۱-۸-۳ روش کار آزمایشگاهی

در این روش ۲ گرم از نمونه آسیاب شده گیاه مورد نظر را در کروزه چینی قرار داده و در دمای ۵۰۰ درجه سانتی گراد به مدت ۲ ساعت تبدیل به خاکستر گردید. به هر یک از نمونه ها ۵ میلی لیتر اسید کلریدریک ۲ نرمال اضافه کرده و در بن­ماری در دمای ۵۶ درجه به مدت ۱۰- ۵ دقیقه قرار داده شد و سپس از کاغد صافی واتمن ۴۲ عبور داده و در نهایت به یک بالن ژوژه ۵۰ میلی لیتری منتقل گردید و با آب مقطر ولرم به حجم ۵۰ میلی لیتر رسانده شد. از این عصاره بدست آمده برای قرائت عناصر کادمیوم، سرب، روی و مس توسط دستگاه جدب اتمی استفاده گردید.

۹-۳ اندازه ­گیری فلزات سنگین در خاک

روش اندازه ­گیری فلزات سنگین با روش DTPA(علی احیایی به نقل از لیندسی و نورول^[۸۶]، ۱۹۹۶) بررسی و مورد تایید قرار گرفت در این روش فلزات سنگین کادمیوم، سرب، روی و مس با DTPA کلات با ثباتی تشکیل می­ دهند که امکان اندازه گیری میکروالمنت­ها در عصاره، فراهم می­ شود.

۱-۹-۳ مواد شیمیایی مورد نیاز

۱- محلول عصاره­گیری دی اتیلن تری آمین پنتا استیک اسید ۰۰۵/۰ مول و ۰۱/۰ مول کلروکلسیم و ۰۱/۰ مول تری اتانول آمین در ۷pH= که به صورت زیر تهیه می­ شود:
مقدار ۲/۱۴۹ گرم تری اتانول آمین خالص و ۶/۰۱۹گرم DTPA و ۷/۱۴ گرم کلروکلسیم را در ۲۰۰ میلی­لیتر آب­مقطر حل و حجم آن را به ۹ لیتر رسانده و PH را با اسید کلریدریک نرمال روی (۰۵/۰± ۳/۷) تنظیم می­ شود. سپس حجم آن به ۱۰ لیتر رسانده می­ شود. از این محلول می­توان تا چند ماه استفاده نمود. استفاده از کلروکلسیم ۰۱/۰ مول برای این است که محیط عصاره­گیری با کلروکلسیم در تعادل باشد و در نتیجه از حلالیت کربنات کلسیم در خاک­های آهکی جلو­گیری نماید.
۲- تهیه محلول استاندارد: محلول­های استاندارد اولیه به صورت تیترازول در دسترس است.

۱۰-۳ محاسبه احتمال خطرپذیری

برای محاسبه احتمال خطرپذیری افراد به بیماری­های غیرسرطانی از فرمول ارائه شده توسط سازمان حفاظت از محیط زیست آمریکا (USEPA) استفاده شد به این ترتیب که ابتدا میزان جذب آلاینده از طریق ماده غذایی به ازای هرکیلوگرم از وزن بدن در روز با بهره گرفتن از فرمول زیر محاسبه شد.
EDI = (CF×IR×FI×EF×ED)/(BW×AT)
EDI : مقدار جذب روزانه آلاینده (μg kg ^-۱ day ^-۱)
CF : غلظت آلاینده در غذا(mg kg ^-۱)
IR : میزان مصرف در روز ( ^-۱ g day) برای سبزیجات برگی ۵۸ گرم در روز و برای سبزیجات غده­ای و ریشه­ای ۳۹ گرم در روز در نظر گرفته شد.
FI: مقدار آلاینده که از طریق غذا جذب بدن می­ شود این ضریب بین ۲۵/۰ تا ۴/۰ متغیر می­باشد. معمولا برای محاسبه خطرپذیری از ضریب ۴/۰ که بدترین حالت را نشان می­دهد استفاده می­ شود. در این مطالعه نیز این ضریب ۴/۰ در نظر گرفته شد.
EF : دفعات مصرف در سال را نشان می­دهد (^-۱ days years)
ED : تعداد سال­هایی را که از این ماده خوراکی استفاده می­ شود را نشان می­دهد ((Years سن افراد بالغ، بزرگسال و کودکان به ترتیب ۳۰، ۶۰ و ۶ ساله در نظر گرفته شد.
BW : وزن بدن ((Kg در این مطالعه در سه گروه افراد بالغ، بزرگسال و کودکان بررسی قرار گرفت که به طور متوسط مقدار وزن آنها به ترتیب ۶/۶۳، ۹/۶۰ و ۷/۳۲ کیلوگرم در نظر گرفته شده است.
AT : از حاصل ضرب ED در تعداد روزهای سال به دست می ­آید (days)
سپس احتمال خطرپذیری (THQ) به بیماری­های غیرسرطانی با بهره گرفتن از فرمول زیر محاسبه شد.
THQ = EDI / RfD
:Oral Reference Dose برای هر عنصر مقدار مشخصی است این مقدار با آزمایش روی حیوانات به دست آمده و نشان دهنده حداکثر غلظتی از عنصر است که برای موجودات مشکلی ایجاد نکرده است و واحد آن نیز(mg Kg^-1 day^-1 ) می­باشد.

۱۱-۳ آنالیز‌های بیولوژیکی

۱-۱۱-۳ جداسازی باکتری‌ها

به منظور جداسازی و شناسایی باکتری­ های مقاوم به نفت سفید، خاک ۴ مزرعه آلوده به نفت سفید شامل ۲ مزرعه سبزیجات برگی و ۲ مزرعه هویج در منطقه شوش مورد آزمایش قرار گرفت. ابتدا ۵ گرم از نمونه خاک هر مزرعه به دقت توزین شده و به طور جداگانه در ارلن‌های ۲۰۰ میلی لیتری قرار داده شد. سپس به خاک موجود در هر ارلن نفت سفید استریل شده به غلظت‌های ۲۵/۱، ۱، ۷۵/۰، ۵/۰ اضافه گردید. باید توجه کرد که برای خاک هر مزرعه ۴ ارلن ۲۰۰ میلی‌لیتری مورد استفاده قرار گرفت . بعد ارلن‌ها را به مدت ۵ روز در شیکر‌ انکو‌باتور با دمای ۳۰ درجه قرار داده شد.

۲-۱۱-۳ رقیق‌سازی

برای رقیق سازی، ۵ گرم از هر نمونه خاک که به دقت توزین شده و با بهره گرفتن از نفت سفید در غلظت‌های مختلف آلوده شده بودند، به طور جداگانه در ۱۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر استریل به صورت سوسپانسیون در آمد. سپس ارلن‌های ۲۰۰ میلی‌لیتری حاوی خاک و آب مقطر در شیکرانکوباتور به مدت ۳۰ دقیقه در rpm 100 قرار داده شد. بعد از این مرحله، نمونه‌ها از ^۱-۱۰ تا ^۴-۱۰ به صورت سریالی (هر بار ۱۰ برابر) رقیق گردید. و از دو غلظت پایانی (^۴-۱۰ و ^۳-۱۰) به منظور جداسازی و شناسایی باکتری‏های مقاوم به نفت سفید استفاده شد. بدین صورت که از دو غلظت پایانی ۱۵۰ میکرولیتر روی سطح محیط کشت نوترینت آگار پخش شده و سپس به مدت ۲۴ ساعت در انکوباتور با دمای ۳۰ درجه سانتی‌گراد نگهداری شد (اسچاد و همکاران^[۸۷]، ۲۰۰۱).

۳-۱۱-۳ خالص­سازی باکتری­ ها

بعد از مرحله جداسازی، ۲۱ کلونی مجزا از لحاظ شکل و ریخت ظاهری از خاک ۴ مزرعه آلوده به نفت سفید (۲ مزرعه سبزی­های برگی شامل جعفری، گشنیز و شوید و ۲ مزرعه هویج) منطقه با دستگاه بینی کولار به منظور خالص­سازی شناسایی شد. برای جلوگیری از بروز آلودگی، آزمایش­های مرحله خالص­سازی در شرایط کاملاً استریل انجام شد. در شرایط استریل، یک کلونی از باکتری با لوپ برداشته شد و به روش کشت چهار منطقه­ای بر روی پتری دیش حاوی نوترینت آگار انتقال داده شد (شکل ۱-۳). نمونه­ها در انکوباتور در دمای ۲۸ درجه سانتی ­گراد قرار داده شده و پس از گذشت ۴۸ ساعت کلنی‌های باکتریایی به وضوح روی سطح پتری­دیش­ها ظاهر می­شوند. کشت باکتری بر روی نوترینت آگار تا رسیدن به کلنی­های تک و خالص‏سازی باکتری­ ها تکرار گردید.

شکل ۱-۳ کشت چهار منطقه­ای

۴-۱۱-۳ تست­های افتراقی برای شناسایی باکتری­ ها

۱-۴-۱۱-۳ تعیین گرم باکتری با آزمایش حلالیت در هیدروکسیدپتاسیم ۳ درصد

این آزمایش به منظور تشخیص سریع واکنش گرم باکتر­ی­ها انجام شد. قطره­ای­ از محلول ۳ درصد هیدروکسید پتاسیم (KOH) روی یک لام تمیز قرار داده شد و مقداری از کشت جوان باکتری روی محیط جامد را به کمک لوپ برداشته با قطره هیدروکسید پتاسیم با تکان دادن سریع و دورانی مخلوط گردید. با توجه به دستور العمل پیشنهادی سیوس­لاو و همکاران^[۸۸] (۱۹۸۲)مبنی بر اینکه در صورت بروز چسبندگی شدید در سوسپانسیون باکتری ظرف حدود ۱۵ ثانیه، سوش مورد آزمایش گرم منفی و در غیر این صورت گرم مثبت تلقی می گردد، نوع باکتری­ ها تشخیص داده شد.
شکل۲-۳ تعیین گرم باکتری­ ها

۲-۴-۱۱-۳ تست KING-B

در این محیط از پروتز پپتون ۲۰ گرم، مونوفسفات هیدروژن پتاسیم (K₂HPO₄) 5/1 گرم، سولفات منیزیم (MgSO₄.7H₂O) 5/1 گرم، گلیسرول ۱۵ میلی‏لیتر و آگار ۱۵ گرم در یک لیتر آب مقطر استفاده شد. محیط اتوکلاو شده در پتری دیش­های استریل ریخته شد. پس از جامد شدن محیط، ایزوله­ها به صورت نقطه­ای به محیط تلقیح شده و به مدت ۲ روز در دمای آزمایشگاه نگهداری شد. ایزوله­هایی که نور سبز یا آبی از خود ساطع ­کردند، به عنوان نتیجه مثبت در نظر گرفته شدند. شمایی از کشت باکتری سودوموناس بر روی محیط کشت آگار غذایی به منظور حصول اطمینان از تست King-B در زیر UV نشان داده شده است (شکل ۳-۳).
شکل ۳-۳ تست king-B

۳-۴-۱۱-۳ تست کاتالاز

برای انجام این تست نیاز به تهیه محلول آب اکسیژنه ۳ درصد است (۳میلی­لیتر از آب اکسیژنه را برداشته و در بالن حجمی ۱۰۰ میلی­لیتری با آب مقطر به حجم رسانیده شد آب اکسیژنه تهیه شده تا زمان آزمایش در یخچال نگهداری شد. یک قطره از محلول آب اکسیژنه ۳ درصد در سطح لام تمیز قرار داده شد و با بهره گرفتن از لوپ استریل بخشی از کلونی را برداشته و در داخل قطره آب اکسیژنه حل گردید. در نمونه­های کاتالاز مثبت، حباب­های اکسیژن ظاهر گردید ولی در نمونه­های کاتالاز منفی، حباب­های اکسیژن مشاهده نگردید (اسچاد و همکاران، ۲۰۰۱).
شکل ۴-۳ تست کاتالاز

۴-۴-۱۱-۳ تست هیدرولیز نشاسته

برای انجام تست هیدرلیز نشاسته از محیط ۸ گرم آگار غذایی، ۱۰ گرم نشاسته سیب­زمینی محلول و یک لیتر آب مقطر برای این آزمایش استفاده شد. محیط فوق اتوکلاو و در پتری­های استریل پخش شد. پس از خشک شدن سطح محیط آگار نشاسته، سوش­ها به صورت لکه روی آن کشت داده شد. پس از ۴-۳ روز نگه­داری در آنکوباتور، هیدرولیز نشاسته با ریختن محلول لوگول روی محیط کشت مورد بررسی قرار گرفت. وجود هاله در اطراف کلنی­ها بیانگر عدم وجود آمیلوز و آمیلوپکتین و عدم وجود هاله نشانه وجود این دو قند در آن نواحی ارزیابی شد (کوان^[۸۹]، ۱۹۷۴).
شکل ۵-۳ تست هیدرولیز نشاسته

۵-۴-۱۱-۳ تست تولید لوان

در این آزمایش محیط کشت آگار غذایی حاوی ۵ درصد سوکروز استفاده گردید. پس از خشک شدن سطح محیط کشت، سوش­ها به صورت لکه روی آن کشت و در انکوباتور نگه­داری شد. ارزیابی سوش­ها پس از ۳ روز بر اساس تشکیل یا عدم تشکیل کلنی­های لعاب­دار و گنبدی صورت گرفت (اسچاد و همکاران، ۲۰۰۱).

۶-۴-۱۱-۳ محیط تخمیری (O/F)