LA (1000cc)

میگروگرم برای

ml1000

۵

۵

۱۰

۱۵

LB(1000cc)

-

۵

۵

۱۰

—————–

LB(cc1000(

میگروگرم برای
ml1000

۵

۵

۱۰

——————

با آب مقطر به حجم مورد نظر رسانده و سپس اتوکلاو می کنیم.
- در زیر هود و کنار شعله، آنتی بیوتیک را به محیط کشت اضافه کرده و به پلیت ها منتقل میکنیم. وپس از خنک شدن پلیت ها را در یخچال نگهداری می کنیم.
پروتکل Compatent:
از محیط کشت سوش DH5α به کمک لوپ و در کنارشعله سلولها را به ml 10 از LB بدون آنتی بیوتیک که در فالکون
cc50 ریخته شده بود منتقل میکنیم و در داخل انکوباتور°C 37 و روی شیکر با سرعت RPM 250 به مدت یک شبانه
کشت میدهیم. صبح روز بعد µL500 از محیط را برداشته و به ML50 محیط LB بدون آنتی بیوتیک که در داخل ارلن است
منتقل کرده و به مدت ۲ ساعت در °C 37 و روی شیکر با سرعت RPM 250 کشت میدهیم. در این فاصله به منظور
نگهداری طولانی مدت سوش باکتری باقیمانده به روش زیر عمل میکنیم.
*روش نگهداری سوش(Stock ):
به منظور نگهداری طولانی مدت سوش باکتری، باقیمانده محیط کشت (ml 5/9) که در فالکون باقیمانده است، در ۴ درجه با
دورg 1600 به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ میکنیم, تا سلولها کاملا ته نشین شوند. سپس با سمپلر محیط کشت را کاملا از
روی سلولها خارج کرده و سپس حدود Lµ ۶۵ محیط تازه روی سلولها ریخته و Lµ ۳۵ گلیسرول (۱۰۰%( اتوکلاو شده به
آن افزوده به آرامی سلولها را مخلوط و با حجمهای مساوی به ده میکروتیوبml 5/1 اتوکلاو شده منتقل کرده، درب آنرا با
پارافیلم محکم بسته و در ۸۰- درجه نگهداری می کنیم.
- OD سلولهای محیط کشت درون ارلن که برای دو ساعت در انکوباتور شیک شده بود را برای اطمینان از رسیدن آنها به فاز
لگاریتمی رشد، بررسی کرده و پس از اطمینان از این موضوع محتوی ارلن را به فالکون ml50 منتقل کرده و به مدت ۱۵
دقیقه بطور کامل در یخ فرو میبریم و سپس در °C 4 با دورg 1600 به مدت ۷ دقیقه سانتریفیوژ میکنیم تا رسوب سلولها
بدست آید. محلول روئی را با سمپلر بطور کامل خالی میکنیم. ‍‍ml 10 cacl2 (100 میلی مولار استریل) به رسوب سلولها
اضافه کرده به آرامی پی پتور میکنیم و به مدت ۳۰ دقیقه بر روی یخ قرار میدهیم. سپس با دور g1100در °C 4 به مدت
۵ دقیقه سانتریفیوژ کرده , و درحالیکه فالکون روی یخ قرار دارد محلول روئی را با سمپلر خارج کرده ومجددا ml10 cacl2
(۱۰۰ میلی مولار استریل) به آن اضافه کرده و به مدت زمان ۳۰ دقیقه بر روی یخ قرار می دهیم . سپس با دور g 1100 در
°C 4 به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ کرده محلول روئی را کاملا خارج میکنیم.انتظار داریم که در این مرحله باکتریها
competent ant شده باشند.