استخراج مواد مؤثره موجود در گیاه به‌وسیله حلال‌های مختلف انجام می‌پذیرد. قابل‌ذکر است که عمل استخراج از قدیم‌الایام مخصوصاً در دوران جالینوس معمول بوده است. عصاره گیری یعنی جداسازی مواد یا بخش‌های فعال‌شده گیاه از اجزای غیرفعال آن توسط حلال مناسب.
۳-۱-۴-۱ انتخاب حلال:
مهم‌ترین و اساسی‌ترین عاملی که باید در استخراج مواد متشکله گیاهان موردتوجه قرار گیرد حلالی است که انتخاب آن به قسمت‌های مختلف گیاه و نیز به مواد متشکله آن بستگی دارد بسیار مشکل خواهد بود که برای هر دسته از ترکیبات خام گیاهی، حلال مخصوصی انتخاب شود زیرا همراه این ترکیبات مواد دیگری نیز وجود دارد که بر روی درجه حلالیت این مواد تأثیر می‌گذارد.

۳-۱-۴-۲ روش‌های استخراج:
۱-روش خیساندن یا ماسراسیون (Maceration)
اصطلاح ماسراسیون از لغت macerate به معنای غوطه‌ور شدن گرفته‌شده است. عمل خیساندن یک عمل قدیمی است که به‌وسیله آب و حلال‌های مختلف صورت می‌گیرد. در این فرایند گیاه خردشده و در یک بطری درب پیچ‌دار ریخته و مدت ۱۴-۱۲ روز روی تکان‌دهنده^[۱] قرار داده و سپس صاف می‌نمایند. عمل خیساندن را معمولاً در حرارت ^c º۲۰-۱۵ و با چند حلال انجام می‌دهند.
۲-روش پرکولاسیون (Percolation)
در این روش بافت‌های گیاهی موردمطالعه را به‌صورت پودر درآورده و در ظرفی به نام پرکولاتور که یک محفظه قیفی شکل که در پایین آن شیر خروجی داشته و به یک ظرف مدرج منتهی می‌شود، به‌صورت کاملاً فشرده قرار داده‌شده حلال اضافه می‌گردد تا کاملاً بافت‌های گیاهی را اشباع کند درب پرکولاتور بسته می‌شود و در این حالت شیر خروجی پرکولاتور نیز بسته است. پس از ۲۴ ساعت شیر پرکولاتور را بازکرده تا عصاره به‌دست‌آمده وارد ظرف مدرج شود.
۳-روش سوکسله (soxhlet extractor)
این روش نیز یکی از روش‌های متداول عصاره گیری است و در موارد زیر از آن‌ها استفاده می‌گردد:
جهت گرفتن مواد چربی، موم و مواد رنگی قبل از استخراج مواد مؤثر گیاه مورد آزمایش
هنگامی‌که اطمینان باشد که حرارت در طول زمان استخراج، ماده مؤثر گیاه مورد آزمایش را تجزیه و خراب نمی‌کند.
هدف از عصاره گیری، بالا بردن غلظت مواد مؤثره و جداسازی و خالص‌سازی و افزایش پایداری این مواد است. موادی را که از طریق استخراج به دست می‌آوریم Excrative و حلالی را که برای تهیه عصاره استفاده می‌گردد، Menstrum و باقی‌مانده گیاه که دورریختنی است را تفاله یا Mare می‌گویند. برای عصاره گیری، قسمت‌های مورداستفاده گیاه ابتدا به قطعات مناسب تقسیم‌شده و سپس توسط حلال عصاره گیری می‌شود. به‌این‌ترتیب عصاره‌ای که به دست می‌آید عصاره مایع نام دارد ولی این عصاره را نمی‌توان برای مدت طولانی نگهداری کرد. همچنین این عصاره با حلال مورداستفاده مخلوط است و باید حلال را بسته به مواد مؤثر گیاه به نحوی تبخیر کرد و عصاره جامد تهیه نمود. البته این در صورتی است که مواد مؤثره گیاه جامد باشد. باید توجه داشت که قبل از عصاره گیری باید ناخالصی‌ها را از بافت‌های گیاهی جدا نمود. به‌منظور استخراج کلیه مواد از گیاه، یعنی عصاره تام، استفاده از یک حلال قطبی ضروری است. از بهترین حلال‌های قطبی می‌توان از متانول و اتانول ۸۰% نام برد که قابلیت حل قسمت عمده مواد گیاه را در خود داشته باشد و نیز مانع از آنزیم اکسیدکننده و هیدرولیز کننده موجود در بافتهای گیاهی می‌شود.
لازم به ذکر است در هیچ عصاره گیری نمی‌توان به‌صورت مطلق مواد فعال گیاه را جدا کرد زیرا مواد غیرفعال هم هرچند به‌صورت جزئی اما همراه با مواد فعال وارد عصاره می‌شوند ولی باید کوشش کرد با انتخاب روش‌ها و حلال‌های مناسب مقدار مواد غیرفعال را در عصاره به حداقل رساند.
الف) مواد مؤثره موردنظر را در خود حل کنند.
ب) حتی‌الامکان مواد غیرفعال را کمتر حل کنند.
ج) بد بو و مضر نباشد.
د) مقرون‌به‌صرفه باشند.
ه) نه‌تنها باعث فساد مواد استخراجی نشوند بلکه از فساد و ناپایداری آن‌ها هم جلوگیری کنند. درصد استخراج مواد بستگی به زمان استخراج دارد. هر چه زمان تماس حلال با گیاه بیشتر باشد، استخراج مواد کامل‌تر است و حاوی مقدار بیشتری از مواد موجود گیاه می‌شود. برای استخراج مواد خاصی از حلال‌های خاص استفاده کرد. بدین معنی که این حلال‌ها باید تنها همان مواد را در خود حل کنند.
۳-۱-۵ اسانس
روغن‌های اسانسی ترکیبات معطری هستند که در اندام‌های مختلف گیاهان یافت می‌گردند. به علت قابلیت تبخیر این مواد در مجاورت هوا و در درجه حرارت اتاق این ترکیبات را روغن‌های فرار^[۲]، روغن‌های اتری^[۳] و یا اسانس^[۴] نیز می‌نامند. این روغن‌ها از قرن شانزدهم میلادی شناخته‌شده بودند و به علت اینکه اغلب آن‌ها دارای عطروطعم خوبی می‌باشند، به‌طور گسترده‌ای در صنایع غذایی، عطرسازی و داروسازی مورداستفاده قرار می‌گیرند.
۳-۱-۶ ساختمان شیمیایی اسانس‌ها
به‌جز در موارد محدود، اسانس‌ها از یک ترکیبات شیمیایی با خطوط نسبی تشکیل یافته‌اند، در اکثر موارد، اسانس‌ها مخلوطی از ترکیباتی می‌باشند که باهم تفاوت دارند. اجزاء اسانس‌ها مواد شدیداً فراری هستند که به نور، گرما و رطوبت حساس هستند. اسانس‌ها از دو بخش مایع و جامد تشکیل‌شده‌اند. قسمت مایع را آلئوپتین^[۵] می‌نامند که ترکیبی از هیدروکربورها می‌باشند و قسمت جامد اسانس را استئاروپتین^[۶] می‌نامند که هیدروکربور اکسیدشده است و معمولاً جامد است. این مواد مقدارشان نسبتاً کمتر است و شامل موادی هستند که در حقیقت، مسئول بوی مشخص یا طعم مخصوص اسانس می‌باشند. استئاروپتین موجود در اسانس‌ها را اغلب به روش انجماد یا روش‌های دیگر به دست می‌آورند. منتول، تیمول، آنتول از استئاروپتین های جامد می‌باشند.
۳-۱-۷ مکانیسم اثر اسانس‌ها
فعالیت ضد میکروبی اسانس‌ها با چند مکانیسم توجیه می‌شود ازجمله آن‌ها ایجاد وقفه در فسفریلاسیون اکسیداتیو یا حل شدن در غشای سیتوپلاسمی و تداخل با ساختمان پروتئینی یا آنزیم و از بین بردن میکروارگانیسم‌ها و یا ایجاد وقفه در فعالیت‌های مربوط به سوکسینات و واکنش‌های وابسته به NADH است که این واکنش‌ها در حضور اسانس با خاصیت ضد میکروبی توقف بیشتری نسبت به فعالیت‌های وابسته به سوکسینات خواهند داشت. درنتیجه غشا از NADH جدا و میزان واکنش سوکسینات دهیدروژناز به کمترین حد خود کاهش می‌یابد. مکانیسم اثر ضد اسپاسم اسانس‌ها به‌درستی روشن نیست اما مکانیسم فرضی عبارت است از ممانعت از انتقال Ca که سبب مهار بیوسنتز پروستاگلاندین می‌گردد.
۳-۱-۸ تهیه اسانس چای سبز
اسانس گیری از برگ چای سبز و به روش Hydrodistillation به کمک دستگاه کلونجر انجام شد. بدین ترتیب که بعد از خشک‌کردن گیاه در محیط سایه و خنک حدود ۱۰۰ گرم خردشده آن را درون یک بالن ژوژه cc100 ریخته و پس از ۴ ساعت تقطیر می‌بایست اسانس چای سبز تشکیل شود ولی پس از انجام آزمایش و تکرار مجدد آن هیچ اسانسی از چای سبز به دست نیامد و پس از تحقیق متوجه شدیم دستگاه لازم برای اسانس گیری از چای سبز در ایران وجود ندارد.
شکل ۳-۱- دستگاه کلونجر
۳-۱-۹ تهیه نمونه میکروبی
در ابتدا بعد از هماهنگی و توجیه کردن آزمایشگاه‌های بیمارستان‌های تشخیص طبی دانشگاه شهید بهشتی برای در اختیار گذاشتن ۱۱۷ نمونه‌ی ادراری از مراجعین مبتلابه UTI در رنج در رنج سنی ۲۰ تا ۴۰ سال این نمونه‌ها جمع‌ آوری شد سپس ۴۷ نمونه از باکتری موردنظر ما (کلبسیلا پنومونیـه) از این نمونه‌های ادراری جمع‌ آوری شد. پس از انتقال نمونه‌ها به آزمایشگاه تحقیقاتی میکروب‌شناسی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، در انکوباتور ۳۷ درجه به مدت ۲۴ ساعت قرار داده شد و شناسایی تأییدی آن‌ها با روش‌های استاندارد و افتراقی میکروبیولوژی انجام شد (۹). درمجموع ۲۴ ایزوله کلبسیلا پنومونیه جمع‌ آوری گردید.
۳-۱-۹-۱ جداسازی و تشخیص ایزوله‌ها
برای تأیید، نمونه‌ها بر روی محیط کشت EMB، مک کانکی آگار کشت داده‌شده و به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد نگهداری شدند. روی محیط مک کانکی باکتری ما ایجاد کلنی‌هایی از جنس M یا مخاطی کرد بعد از انکوباسیون از کلنی‌های مشکوک به کلبسیلا پنومونیه لام مستقیم تهیه‌کرده و در صورت دیدن باسیل‌های گرم منفی، کارهای تشخیصی زیر انجام شد:
از تست‌های مرسوم آزمایشگاهی شامل تست اکسیداز، کشت در محیط‌های TSI،SIM،MR،VP، لیزین دکربوکسیلاز، سیترات، اوره و …. استفاده گردید.
نتایج تست‌های افتراقی به‌صورت:
۱) اوره مثبت
۲) ایندول منفی
۳). سیترات مثبت
۴) گلوکزمثبت
۵) لاکتوز مثبت
۶) گاز منفی
۷).H2S منفی
۸) لام تحرک برای اطمینان خاطر از نمونه گرفتیم و اثبات شد که باکتری کلبسیلا ما بدون تحرک است.
و با توجه به تست‌هایی که گفتیم و انجام دادیم ثابت کردیم که نمونه‌ی ما کلبسیلا پنومونیه است.
سپس با توجه به جدول CLSI سال ۲۰۱۳ دو آنتی‌بیوتیک را که در این مورد قابل‌استفاده بود را انتخاب کردیم (کوتریموکسازول – آمیکاسین). پس از شناسایی باکتری‌ها حساسیت و مقاومت آن‌ها را نسبت به ۲ آنتی‌بیوتیک آمیکاسین و کوتریموکسازول توسط آزمایش‌های MIC و Disc Diffusion ارزیابی شد.
۳-۱-۹-۲ رنگ‌آمیزی گرم
پس از رشد باکتری در محیط‌های اختصاصی، برای تائید از کلنی‌های مشکوک، لام تهیه شد و توسط رنگ‌آمیزی گرم، موردبررسی قرار گرفتند. بهتر است که جهت رنگ‌آمیزی گرم از باکتری جوان با کشت ۲۴ ساعته استفاده شود تا مورفولوژی باکتری ازنظر شکل ظاهری و رنگ گرم دستخوش تغییرات نگردد. در محیط کشت تازه، باکتری کلبسیلا پنومونیه به‌صورت باسیل گرم منفی مشاهده می‌شود. برای انجام رنگ‌آمیزی گرم به‌صورت زیر عمل می‌کنیم
۱) تهیه گسترش از باکتری‌های رشد یافته روی محیط کشت اختصاصی
۲) خشک شدن گسترش در معرض هوا
۳) فیکس کردن باکتری روی لام توسط حرارت
۴) استفاده از رنگ کریستال ویوله روی اسمیر تهیه شده به مدت ۱ دقیقه
۵) شستشوی لام با جریان ملایم آب
۶) استفاده از رنگ لوگل به‌عنوان تثبیت‌کننده به مدت ۱ دقیقه
۷) شستشوی لام با جریان ملایم آب