۱-۸-۳ روش کار آزمایشگاهی
در این روش ۲ گرم از نمونه آسیاب شده گیاه مورد نظر را در کروزه چینی قرار داده و در دمای ۵۰۰ درجه سانتی گراد به مدت ۲ ساعت تبدیل به خاکستر گردید. به هر یک از نمونه ها ۵ میلی لیتر اسید کلریدریک ۲ نرمال اضافه کرده و در بنماری در دمای ۵۶ درجه به مدت ۱۰- ۵ دقیقه قرار داده شد و سپس از کاغد صافی واتمن ۴۲ عبور داده و در نهایت به یک بالن ژوژه ۵۰ میلی لیتری منتقل گردید و با آب مقطر ولرم به حجم ۵۰ میلی لیتر رسانده شد. از این عصاره بدست آمده برای قرائت عناصر کادمیوم، سرب، روی و مس توسط دستگاه جدب اتمی استفاده گردید.
۹-۳ اندازه گیری فلزات سنگین در خاک
روش اندازه گیری فلزات سنگین با روش DTPA(علی احیایی به نقل از لیندسی و نورول[۸۶]، ۱۹۹۶) بررسی و مورد تایید قرار گرفت در این روش فلزات سنگین کادمیوم، سرب، روی و مس با DTPA کلات با ثباتی تشکیل می دهند که امکان اندازه گیری میکروالمنتها در عصاره، فراهم می شود.
۱-۹-۳ مواد شیمیایی مورد نیاز
۱- محلول عصارهگیری دی اتیلن تری آمین پنتا استیک اسید ۰۰۵/۰ مول و ۰۱/۰ مول کلروکلسیم و ۰۱/۰ مول تری اتانول آمین در ۷pH= که به صورت زیر تهیه می شود:
مقدار ۲/۱۴۹ گرم تری اتانول آمین خالص و ۶/۰۱۹گرم DTPA و ۷/۱۴ گرم کلروکلسیم را در ۲۰۰ میلیلیتر آبمقطر حل و حجم آن را به ۹ لیتر رسانده و PH را با اسید کلریدریک نرمال روی (۰۵/۰± ۳/۷) تنظیم می شود. سپس حجم آن به ۱۰ لیتر رسانده می شود. از این محلول میتوان تا چند ماه استفاده نمود. استفاده از کلروکلسیم ۰۱/۰ مول برای این است که محیط عصارهگیری با کلروکلسیم در تعادل باشد و در نتیجه از حلالیت کربنات کلسیم در خاکهای آهکی جلوگیری نماید.
۲- تهیه محلول استاندارد: محلولهای استاندارد اولیه به صورت تیترازول در دسترس است.
۱۰-۳ محاسبه احتمال خطرپذیری
برای محاسبه احتمال خطرپذیری افراد به بیماریهای غیرسرطانی از فرمول ارائه شده توسط سازمان حفاظت از محیط زیست آمریکا (USEPA) استفاده شد به این ترتیب که ابتدا میزان جذب آلاینده از طریق ماده غذایی به ازای هرکیلوگرم از وزن بدن در روز با بهره گرفتن از فرمول زیر محاسبه شد.
EDI = (CF×IR×FI×EF×ED)/(BW×AT)
EDI : مقدار جذب روزانه آلاینده (μg kg -۱ day -۱)
CF : غلظت آلاینده در غذا(mg kg -۱)
IR : میزان مصرف در روز ( -۱ g day) برای سبزیجات برگی ۵۸ گرم در روز و برای سبزیجات غدهای و ریشهای ۳۹ گرم در روز در نظر گرفته شد.
FI: مقدار آلاینده که از طریق غذا جذب بدن می شود این ضریب بین ۲۵/۰ تا ۴/۰ متغیر میباشد. معمولا برای محاسبه خطرپذیری از ضریب ۴/۰ که بدترین حالت را نشان میدهد استفاده می شود. در این مطالعه نیز این ضریب ۴/۰ در نظر گرفته شد.
EF : دفعات مصرف در سال را نشان میدهد (-۱ days years)
ED : تعداد سالهایی را که از این ماده خوراکی استفاده می شود را نشان میدهد ((Years سن افراد بالغ، بزرگسال و کودکان به ترتیب ۳۰، ۶۰ و ۶ ساله در نظر گرفته شد.
BW : وزن بدن ((Kg در این مطالعه در سه گروه افراد بالغ، بزرگسال و کودکان بررسی قرار گرفت که به طور متوسط مقدار وزن آنها به ترتیب ۶/۶۳، ۹/۶۰ و ۷/۳۲ کیلوگرم در نظر گرفته شده است.
AT : از حاصل ضرب ED در تعداد روزهای سال به دست می آید (days)
سپس احتمال خطرپذیری (THQ) به بیماریهای غیرسرطانی با بهره گرفتن از فرمول زیر محاسبه شد.
THQ = EDI / RfD
:Oral Reference Dose برای هر عنصر مقدار مشخصی است این مقدار با آزمایش روی حیوانات به دست آمده و نشان دهنده حداکثر غلظتی از عنصر است که برای موجودات مشکلی ایجاد نکرده است و واحد آن نیز(mg Kg-1 day-1 ) میباشد.
۱۱-۳ آنالیزهای بیولوژیکی
۱-۱۱-۳ جداسازی باکتریها
به منظور جداسازی و شناسایی باکتری های مقاوم به نفت سفید، خاک ۴ مزرعه آلوده به نفت سفید شامل ۲ مزرعه سبزیجات برگی و ۲ مزرعه هویج در منطقه شوش مورد آزمایش قرار گرفت. ابتدا ۵ گرم از نمونه خاک هر مزرعه به دقت توزین شده و به طور جداگانه در ارلنهای ۲۰۰ میلی لیتری قرار داده شد. سپس به خاک موجود در هر ارلن نفت سفید استریل شده به غلظتهای ۲۵/۱، ۱، ۷۵/۰، ۵/۰ اضافه گردید. باید توجه کرد که برای خاک هر مزرعه ۴ ارلن ۲۰۰ میلیلیتری مورد استفاده قرار گرفت . بعد ارلنها را به مدت ۵ روز در شیکر انکوباتور با دمای ۳۰ درجه قرار داده شد.
۲-۱۱-۳ رقیقسازی
برای رقیق سازی، ۵ گرم از هر نمونه خاک که به دقت توزین شده و با بهره گرفتن از نفت سفید در غلظتهای مختلف آلوده شده بودند، به طور جداگانه در ۱۰۰ میلیلیتر آب مقطر استریل به صورت سوسپانسیون در آمد. سپس ارلنهای ۲۰۰ میلیلیتری حاوی خاک و آب مقطر در شیکرانکوباتور به مدت ۳۰ دقیقه در rpm 100 قرار داده شد. بعد از این مرحله، نمونهها از ۱-۱۰ تا ۴-۱۰ به صورت سریالی (هر بار ۱۰ برابر) رقیق گردید. و از دو غلظت پایانی (۴-۱۰ و ۳-۱۰) به منظور جداسازی و شناسایی باکتریهای مقاوم به نفت سفید استفاده شد. بدین صورت که از دو غلظت پایانی ۱۵۰ میکرولیتر روی سطح محیط کشت نوترینت آگار پخش شده و سپس به مدت ۲۴ ساعت در انکوباتور با دمای ۳۰ درجه سانتیگراد نگهداری شد (اسچاد و همکاران[۸۷]، ۲۰۰۱).
۳-۱۱-۳ خالصسازی باکتری ها
بعد از مرحله جداسازی، ۲۱ کلونی مجزا از لحاظ شکل و ریخت ظاهری از خاک ۴ مزرعه آلوده به نفت سفید (۲ مزرعه سبزیهای برگی شامل جعفری، گشنیز و شوید و ۲ مزرعه هویج) منطقه با دستگاه بینی کولار به منظور خالصسازی شناسایی شد. برای جلوگیری از بروز آلودگی، آزمایشهای مرحله خالصسازی در شرایط کاملاً استریل انجام شد. در شرایط استریل، یک کلونی از باکتری با لوپ برداشته شد و به روش کشت چهار منطقهای بر روی پتری دیش حاوی نوترینت آگار انتقال داده شد (شکل ۱-۳). نمونهها در انکوباتور در دمای ۲۸ درجه سانتی گراد قرار داده شده و پس از گذشت ۴۸ ساعت کلنیهای باکتریایی به وضوح روی سطح پتریدیشها ظاهر میشوند. کشت باکتری بر روی نوترینت آگار تا رسیدن به کلنیهای تک و خالصسازی باکتری ها تکرار گردید.
شکل ۱-۳ کشت چهار منطقهای
۴-۱۱-۳ تستهای افتراقی برای شناسایی باکتری ها
۱-۴-۱۱-۳ تعیین گرم باکتری با آزمایش حلالیت در هیدروکسیدپتاسیم ۳ درصد
این آزمایش به منظور تشخیص سریع واکنش گرم باکتریها انجام شد. قطرهای از محلول ۳ درصد هیدروکسید پتاسیم (KOH) روی یک لام تمیز قرار داده شد و مقداری از کشت جوان باکتری روی محیط جامد را به کمک لوپ برداشته با قطره هیدروکسید پتاسیم با تکان دادن سریع و دورانی مخلوط گردید. با توجه به دستور العمل پیشنهادی سیوسلاو و همکاران[۸۸] (۱۹۸۲)مبنی بر اینکه در صورت بروز چسبندگی شدید در سوسپانسیون باکتری ظرف حدود ۱۵ ثانیه، سوش مورد آزمایش گرم منفی و در غیر این صورت گرم مثبت تلقی می گردد، نوع باکتری ها تشخیص داده شد.
شکل۲-۳ تعیین گرم باکتری ها
۲-۴-۱۱-۳ تست KING-B
در این محیط از پروتز پپتون ۲۰ گرم، مونوفسفات هیدروژن پتاسیم (K2HPO4) 5/1 گرم، سولفات منیزیم (MgSO4.7H2O) 5/1 گرم، گلیسرول ۱۵ میلیلیتر و آگار ۱۵ گرم در یک لیتر آب مقطر استفاده شد. محیط اتوکلاو شده در پتری دیشهای استریل ریخته شد. پس از جامد شدن محیط، ایزولهها به صورت نقطهای به محیط تلقیح شده و به مدت ۲ روز در دمای آزمایشگاه نگهداری شد. ایزولههایی که نور سبز یا آبی از خود ساطع کردند، به عنوان نتیجه مثبت در نظر گرفته شدند. شمایی از کشت باکتری سودوموناس بر روی محیط کشت آگار غذایی به منظور حصول اطمینان از تست King-B در زیر UV نشان داده شده است (شکل ۳-۳).
شکل ۳-۳ تست king-B
۳-۴-۱۱-۳ تست کاتالاز
برای انجام این تست نیاز به تهیه محلول آب اکسیژنه ۳ درصد است (۳میلیلیتر از آب اکسیژنه را برداشته و در بالن حجمی ۱۰۰ میلیلیتری با آب مقطر به حجم رسانیده شد آب اکسیژنه تهیه شده تا زمان آزمایش در یخچال نگهداری شد. یک قطره از محلول آب اکسیژنه ۳ درصد در سطح لام تمیز قرار داده شد و با بهره گرفتن از لوپ استریل بخشی از کلونی را برداشته و در داخل قطره آب اکسیژنه حل گردید. در نمونههای کاتالاز مثبت، حبابهای اکسیژن ظاهر گردید ولی در نمونههای کاتالاز منفی، حبابهای اکسیژن مشاهده نگردید (اسچاد و همکاران، ۲۰۰۱).
شکل ۴-۳ تست کاتالاز
۴-۴-۱۱-۳ تست هیدرولیز نشاسته
برای انجام تست هیدرلیز نشاسته از محیط ۸ گرم آگار غذایی، ۱۰ گرم نشاسته سیبزمینی محلول و یک لیتر آب مقطر برای این آزمایش استفاده شد. محیط فوق اتوکلاو و در پتریهای استریل پخش شد. پس از خشک شدن سطح محیط آگار نشاسته، سوشها به صورت لکه روی آن کشت داده شد. پس از ۴-۳ روز نگهداری در آنکوباتور، هیدرولیز نشاسته با ریختن محلول لوگول روی محیط کشت مورد بررسی قرار گرفت. وجود هاله در اطراف کلنیها بیانگر عدم وجود آمیلوز و آمیلوپکتین و عدم وجود هاله نشانه وجود این دو قند در آن نواحی ارزیابی شد (کوان[۸۹]، ۱۹۷۴).
شکل ۵-۳ تست هیدرولیز نشاسته
۵-۴-۱۱-۳ تست تولید لوان
در این آزمایش محیط کشت آگار غذایی حاوی ۵ درصد سوکروز استفاده گردید. پس از خشک شدن سطح محیط کشت، سوشها به صورت لکه روی آن کشت و در انکوباتور نگهداری شد. ارزیابی سوشها پس از ۳ روز بر اساس تشکیل یا عدم تشکیل کلنیهای لعابدار و گنبدی صورت گرفت (اسچاد و همکاران، ۲۰۰۱).
۶-۴-۱۱-۳ محیط تخمیری (O/F)