واسرشته‏سازی
اتصال نشانگر
بسط نشانگر توسط آنزیم

۹۵
Ta
۷۲

۳۰ ثانیه
۳۰ ثانیه
۱دقیقه

۱

بسط نهایی نشانگر

۷۲

۱۰ دقیقه

۱

مرحله نگهداری در ترموسایکلر

۴

۵ دقیقه

مرحله نگهداری

۲۰-

∞

Ta= دمای اتصال با توجه به نوع نشانگر تعیین شد.
۳-۶-۲ مشاهده محصولات PCR
الف- الکتروفورز نمونه
پس از پایان واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز، ۱۰ میکرولیتر از محصول واکنش را با ۱ میکرولیتر بافر بارگذاری^۱[۱۲۵]X 6 مخلوط و به چاهک(غلظت ژل آگارز مورد استفاده ۵/۱ درصد و بافر بکار رفتهTBE، X 5/0) منتقل گردید. در کنار نمونه‌های مورد بررسی به منظور تخمین طول محصول واکنش بسته به اندازه‌ی قطعه‌ی تکثیری، ۸/۰ میکرولیتر سایز نشانگر^[۱۲۶] bp 100 یا kb1 شرکت Fermentas استفاده شد.
ب- تهیه‌ی ژل آگارز یک و نیم درصد
برای ساخت ۴۰ میلی‎‏لیتر محلول ژل آگارز ۵/۱ درصد، میزان ۵۵/۰ گرم آگارز، درون ارلن ریخته شد و ۴۰ میلی‏لیتر بافر TBE به آن اضافه گردید. ارلن در داخل مایکروفر قرار داده شد تا پودر آگارز در بافر کاملاً حل شده و محلول شفافی بدست آید. جهت رنگ‌آمیزی ژل از ۵/۱ میکرولیتر DNA safe stain استفاده گردید، این ماده حساس به حرارت می‌باشد به همین علت پس از خنک شدن کامل ژل به آن اضافه و مخلوط شد، سپس در قالب مخصوص ژل^[۱۲۷] ریخته و پس از بستن ژل، درون تانک الکتروفورز قرار داده شد. الکتروفورز با ولتاژ ۹۰ ولت، شدت جریان ۱۰۰ میلی‏آمپر و قدرت ۵۰ وات به مدت ۱۰۵ دقیقه در دستگاه GEL XL، صورت گرفت.

ج- مشاهده‌ قطعات PCR
پس از پایان الکتروفورز، ژل از تانک خارج گردید و قطعات تکثیر شده تحت تأثیر نور فرابنفش (با طول موج ۲۵۴ نانومتر) توسط دستگاه ژل‌داک^[۱۲۸]شرکت UVI TEC Cambridge مشاهده شد و عکس ژل ثبت گردید.
۳-۷ تجزیه و تحلیل داده‌های مولکولی
۳-۷-۱ امتیازبندی باندها
برای تجزیه و تحلیل باندها می‏بایست اندازه باندها مشخص شود که این عمل به دو طریق قدیمی اندازه‏گیری با خط‏کش و روش جدید استفاده از نرم‏افزار UV doc انجام می‏شود که البته برای انجام این کار باید از نشانگرهای اندازه یا Ladder به عنوان اندازه معیار کمک گرفته شود. در نهایت باندها به‌صورت صفر(عدم وجود باند) و یک (وجود باند) امتیازبندی شدند.
۳-۷-۲ آنالیز داده‌های مولکولی
در این تحقیق از نرم‏افزار NTSYSpc^[129] ۲٫۰۲e برای بدست آوردن فواصل و ضرایب تشابه ژنتیکی، رسم دندروگرام و تجزیه به مختصات اصلی^[۱۳۰]استفاده گردید.
۳-۷-۳ شاخص محتوای چند شکلی PIC
پارامتر PIC (فرمول۳-۱) معادل تنوع ژنتیکی بوده و قدرت تفکیک یک نشانگر را به واسطه تعداد الل‏های مکان‏ژنی نشانگر و فراوانی نسبی این الل‏ها در جمعیت تحت مطالعه نشان می‏دهد. که میزان آن می‏تواند بین صفر تا یک متغیر باشد(رولدن رویز^[۱۳۱] و همکاران، ۲۰۰۰). در منابع بیومتری برای محاسبه PIC با توجه به نشانگر و مواد ژنتیکی مورد مطالعه از روش‌های گوناگونی استفاده می‌شود. در این مطالعه از رابطه ۱-۳رولدن‌رویز و همکاران (۲۰۰۰) برای محاسبه این ضریب استفاده شد
رابطه ۱-۳٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫٫ PIC=1-Pi (1-Pi )
Pi فراوانی‌ آلل‌های i‌ام برای هر جایگاه
۳-۷-۴ ضریب کوفنتیک
یکی از روش‌های مقایسه کارایی الگوریتم‌های مختلف خوشه‌بندی تخمین ضریب همبستگی کوفنتیک می‌باشد که در آن همبستگی بین ماتریس شباهت یا فاصله به عنوان ورودی تجزیه خوشه‌ای با ماتریس کوفنتیک محاسبه شده براساس دندروگرام که به عنوان خروجی تجزیه می‌باشد، برآورد می‌گردد.
۳-۷-۵ تجزیه به مولفه‌های اصلی
تجزیه به مولفه‌های اصلی از تکنیک‌های چند متغیره‌ است که کاربرد زیادی در تجریه تنوع ژنتیکی و روشی برای کاستن حجم داده‌ها به منظور روشن ساختن روابط بین دو یا چند متغیر و توجیه تغییرات کل داده‌های اصلی و اولیه به وسیله تعداد محدودی از متغیرهای جدید مستقل به نام مولفه‌های اصلی می‌باشد که مقدار کل تغییرات را روی محور مؤلفه های اصلی نشان می‌دهد(نی^[۱۳۲]، ۱۹۷۷). مؤلفه اول بیشترین مقدار تغییرات را در بر می‌گیرد . اولین مؤلفه بیشترین تغییر پذیری موجود در داده های اصلی را بیان می کند و بقیه آن درمؤلفه های بعدی قرار می گیرد. بدین ترتیب دومین مؤلفه، حداکثر تغییرپذیری را که توسط مؤلفۀ اول بیان نشده وبا آن همبستگی نداشته را بیان می‌کند و به همین شکل مؤلفۀهای بعدی قرار می‌گیرند(جولیف^[۱۳۳]، ۱۹۸۶).
فصل چهارم
نتایج و بحث