۴-۸ بحث
۴-۸-۱ انتقال ژن به گیاهان گندم
علی رغم مزایای زیادی که جنین نابالغ در مطالعات انتقال ژن گندم دارد ولی تولید جنین نابالغ معمولا زمان بر بوده و بدست آوردن آن در تمام فصول سال مشکل است. همچنین مطالعات نشان داده که شرایط رشدی گیاه مادری جنین، پاسخ جنین نابالغ به باززایی و انتقال ژن به را تحت تاثیر خود قرار می دهند. لذا استفاده از ریزنمونه های دیگر نیز می تواند مهم باشد. این مسئله باعث شد که محققین استفاده از ریز نمونه های دیگر را نیز مورد توجه قرار دهند (Turhan and Baser., 2004).
راندمان انتقال ژن در گیاهان نسبت پایینی است که این راندمان در گیاهان تک لپه به مراتب پایین تر می باشد. از مجموع ۸۰۰ جنین بالغ گندم که به عنوان ریز نمونه استفاده شد ۴۰ گیاه وارد مرحله ریشه زایی شد. از این تعداد، ۱۵ گیاهان با بهره گرفتن از انجام PCR تراریخت تشخیص داده شد. راندمان تراریختی ۹/۱درصد بالاتر از راندمان ۲۸/۱ درصد تراریختی به دست آمده توسط پانتیک و همکارانش بود که از جنین بالغ گندم به عنوان ریزنمونه استفاده کردند (patnaik et al., 2006). پزتاکویچ و همکارانش با بهره گرفتن از سویه LBA4404 و حامل فوق دوگانه با عامل گزینشگر هایگرومایسین راندمان تراریختی ۳/۲ بدست آوردند (Przetakiewicz et al., 2004). کانامایسین یکی از معمول ترین عوامل گزینشگری است که برای انتخاب گیاه تراریخت مورد استفاده قرار می گیرد اما این سیستم انتخابی برای استفاده در گیاهان تک لپه از کارایی لازم برخوردار نیست. که آن را به مقاومت داخلی گیاهان تک لپه نسبت به این آنتی بیوتیک نسبت می دهند (Wlimink and Dons., 1993). در این تحقیق نیز استفاده از کانامایسین به عنوان عامل انتخابی نتیجه ای در بر نداشت که همسو با نتایج بدست آمده دیگر پژوهش ها می باشد. هنگامی که ژن nptII به عنوان نشانگر گزینشگر مورد استفاده قرار می گیرد و عامل انتخابی کانامایسین از کارایی لازم برخوردار نباشد، استفاده از دیگر آنتی بیوتیک های مشابه مانند جنتیسین پیشنهاد می شود. در این پژوهش نیز هنگامی که جنتیسین (G418) با کانامایسین جایگزین شد نتایج بهتر و در نهایت گیاهان تراریخت بدست آمد.

سویه آگروباکتریوم، نوع حامل ، ریزنمونه انتخاب شده، مدت زمان پیش کشت، مدت زمان و شرایط تلقیح و همکشتی، وجود استوسرینگان در محیط از جمله عواملی هستند که در موفقیت انتقال ژن به گیاهان با آگروباکتریوم دخالت دارند (Razzaq et al., 2010). استفاده از سه سویه باکتری آگروباکتریوم C58، LBA4404 و AGL0 تاثیر سویه بر راندمان انتقال ژن را به اثبات رساند به طوری که سویه LBA4404 عملکرد بهتری را نشان داد لذا در ادامه کار این سویه مورد استفاده قرار گرفت که تمام گیاهان بدست آمده حاصل استفاده از این سویه بود.
با توجه به این که ژنوتیپ از جمله عوامل تاثیر گذار پاسخ گندم به باززایی در کشت بافت است (; Dodig et al., 2006; Mitic et al., 2006; Farooq et al., 2004;) این مورد نیز در پژوهش حاضر در نظر گرفته شد. بنابراین ارقام حساس به تنش شیراز و الموت مورد استفاده قرار گرفت. نتایج نشان داد که ژنوتیپ الموت دارای باززایی بهتری بود لذا در ادامه پژوهش فقط این ژنوتیپ مورد استفاده قرار گرفت.
بررسی بیان ژن WDREB در گندم های تراریخت با بهره گرفتن از تکنیک Real-Time PCR نشان داد که پروموتر ۳۵S بکار برده شده عملکرد خوبی داشته و در بعضی از گیاهان ژن WDREBبیان بسیار بالایی دارد.
۴-۸-۲ نتیجه گیری کلی
گندم (Triticum spp) مهم ترین گیاه زراعی دنیا است و تنش ها مهمترین عامل کاهش دهنده عملکرد این غله مهم می باشند. افزایش تقاضا برای محصولات غذایی با توجه به جمعیت در حال رشد جهان موضوعی است که نمی توان آن را نادیده گرفت. تاریخچه استفاده از روش های علمی برای بهبود گیاهان زراعی به کشف دوباره قانون مندل بر می گردد. در بهنژادی سنتی از فنون هایی مانند تلاقی، تلاقی برگشتی و انتخاب استفاده می شود. به علت فقدان ژن های ایجاد کننده مقاومت کافی به بسیاری از تنش های زیستی و غیر زیستی در بانک ژرم پلاسم موجود، تغییر بسیاری خصوصیات لازم و مطلوب گندم برای حل مشکلات تولید محصول را نمی توان با روش های بهنژادی سنتی بدست آورد (Sahrawat et al., 2003).
به هرحال فنون های سنتی بهنژادیی که مبتنی بر فرایند های تلاقی، تلاقی برگشتی و انتخاب هستند، زمان بر بوده و به سختی می توانند با تکامل سریع آفات و میکروارگانیسم های بیماری زا رقابت کنند بنابراین گسترش تکنولوژی های درون شیشه ای که مکمل روش های سنتی بهنژادیی گندم هستند، برای تولید ارقام جدید با صفات مطلوب، مفید می باشند. برخلاف روش های بهنژادیی سنتی که از ارقام اهلی و جنس های وابسته به آنها به عنوان منبعی از ژن ها برای بهبود ارقام موجود استفاده می کند، روش های زیست فناوریکی ژن هایی از موجودات مختلفی را می توانند مورد استفاده قرار دهند لذا دسترسی به ذخیره ژنی بیشتری را امکان پذیر می کنند (Patnaik and Khurana., 2001).
از آنجا که مقاومت به تنش های غیر زیستی از جمله صفات کمی است و به وسیله تعداد زیادی از عوامل ژنتیکی کنترل می شود، انتقال تنها یک ژن عملکردی نمی تواند منجر به ایجاد تمامی تغییرات سلولی لازم جهت ایجاد مقاومت به تنش شود. در حالی که شناسایی و انتقال ژن های تنظیمی به گیاهان منجر به القای چندین مسیر موثر در مقاومت به تنش ها شده و تحمل گیاهان به تنش ها را افزایش می دهد.
در این پژوهش فرم فعال عامل رونویسی WDREB2 به عنوان یکی از ژنهای تنظیمی مهم که
از گیاه گندم مقاوم به تنش جدا شده، انتقال آن به رقم گندم حساس صورت گرفته است. عوامل رونویسی DREB عضوی از خانواده AP2/ERF هستند. این خانواده گروه مهمی از عوامل رونویسی را شامل می شود که در پاسخ به تنش های غیر زیستی نقش بسزایی دارند (Agarwal et al., 2007). بیان عامل رونویسی WDREB2 تحت تنش های سرما و خشکی القا می شود. این ژن از طریق اتصال به ناحیه پروموتری ژن های پایین دست و فعال سازی رونویسی، بیان ژن های القا شونده تحت شرایط تنش را تنظیم نموده و منجر به افزایش مقاومت به تنش ها می شود. به طور کلی پیشرفت در زمینه بهنژادی گیاهان برای مقاومت به تنش های غیر زیستی متکی به فهم روشن مسیر های القای مقاومت به تنش ها و تراریختی پایدار گیاهان با بهره گرفتن از ژن های موثر در مقاومت به تنش ها می باشد. با توجه به جایگاه مهم گندم در جیره غذایی انسان، استراتژیک بودن این محصول و قرار گرفتن کشور در کمربند خشکی، این پزوهش می تواند نقشی ارزیستی در بهبود مقاومت گندم به تنش ها داشته باشد. همچنین عدم شناخت کامل از اثرات بیان افزایش یافته این ژن در گندمیان، نتیجه حاصل از این پژوهش می تواند اطلاعات ارزشمندی در رابطه با نقش این ژن در پاسخ به تنش ارائه دهد.
۴-۸-۳ پیشنهادات
بررسی گیاهان گندم تراژن با بهره گرفتن از فنون مولکولی نظیر لکه گذاری ساترن و سترن
بررسی میزان مقاومت گیاهان تراریخت در تمام تنش های غیر زیستی
انتقال ژن WDREB2 تحت پروموتر های القایی به وسیله تنش های غیر زیستی
مطالعه اثر بیان پایدار ژن WDREB2 بر ژن های پایین دست
منابع
امام، ی. ۱۳۸۶٫ زراعت غلات (چاپ سوم). دانشگاه شیراز. ۱۹۰ص.
سازگاری، س. و ع. نیازی. ۱۳۸۹٫ جداسازی cDNA ژن WDREB2 و انتقال آن به گوجه فرنگی: راهکاری جهت بهبود مقاومت به تنش های غیر زنده. پایان نامه کارشناسی ارشد رشته بیوتکنولوژی ، پژوهشکده بیوتکنولوژی دانشگاه شیراز.
صحرائیان، م. و م. بخشوده. ۱۳۸۶٫ بررسی پیوستگی بازارهای داخلی و جهانی گندم در ایران. اقتصادکشاورزی و توسعه. ج۵۹: ۱۱۸-۹۷٫
Abdul-razzak, N. 2009. Evaluation of hexaploid wheat varieties for making bread by high molecular weight (HMW) and low molecular weight (LMW) analysis. Jordan Journal of Biological Science, 2:55-62.
Abumhadi, N., K. Kamenarova., E. Todorovska., G. Dimov., S. Takumi., C. Nakamura., H. Anzai and A. Atanassov. 2005. Effects of three promoters in barley transformation by particle bombardment of mature and immature embryos. Biotechnology and Biotechnological Equipment, 19:63-69.
Abumhadi, N., K. Kamenarova., E. Todorovska., M. Stoyanova., G. Dimov., A. Trifonova., S. Takumi., C. Nakamura., H. Anzai., K. Gecheff and A. Atanassov. 2005. Biotechnological approaches for cereal crops improvement- part I: Development of in vitro culture and genetic transformation technologies in cereals. Biotechnology and Biotechnological Equipment, 19:72-90
Agarwal, P., P. K. Agarwal., S. Nair., S. K. Sopory and M. K. Reddy. 2007. Stress-inducible DREB2A transcription factor from pennisetum glaucum is a phosphoprotein and its phosphorylation negatively regulates its DNA-binding activity. Molecular Genetics and Genomics, 277:189-198.
Ahmad, A., H. Zhong., W. Wang and M. B. Sticklen. 2002. Shoot apical meristem: in vitro regeneration and morphogenesis in wheat (Triticum aestivum L.). In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant, 38:163-167.
Altpeter, F., V. Vasil., V. Srivastava and I. K. Vasil. ۱۹۹۶٫ Integration and expression of the high-molecular-weight glutenin subunit 1Ax1 gene into wheat. Nature Biotechnology, 14:1155-1159.
Altpeter, F., I. Diaz., H. McAuslane., K. Gaddour., P. Carbonero and I. K. Vasil. 1999. Increased insect resistance in transgenic wheat stably expressing trypsin inhibitor CMe. Molecular Breeding, 5:53-63.
Amoah, B. k., H. Wu., C. Sparks and H. D. jones. 2001. Factors influencing Agrobacterium-mediated transient expression of uidA in wheat inflorescence tissue. Journal of Experimental Botany, 52:1135-1142.
An, G., M. A. Costa and S. B. Ha. 1990. Nopaline synthase promoter is wound lnducible and auxin inducible. The Plant Cell, 2:225-233
Arnon, I. 1972. Crop Production in Dry Regions, Vol. II: Systematic Treatments of the Principal Crops. Plant Science Monograph. Leonard Hill Books. London. 683 pp.
Assem, S. K., H. El-Itriby., H. Hussein Ebtissam., M. Saad and M. Madkour. 2002. Comparison of the efficiency of some novel maize promoters in monocot and dicot plants. Arab Journal of Biotechnology, 5:57-66.
Barcelo, P., A, Vazquez and A. Martin. 1989. Somatic embryogenesis and regeneration from Tritordeum. Plant Breeding, 103:235-240.
Barcelo, P., C. Hegel., D. Becker., A. Martin and H. Lorz. 1994. Transgenic cereal (tritordeum) plants obtained at high efficiency by microprojectile bombardment of inflorescence tissue. The Plant Journal, 5:583-592.
Barcelo, P., A. Vazquez and A. Martin. 1998. Somatic Embryogenesis and plant regeneration from tritordeum. Plant Breeding, 103:235-240.
Baron, C., P. Zambryski. 1995. The plant response in pathogenesis, symbiosis and wounding: variations on a common theme? Annual Review of Genetics, 29:107-129.
Barro, F., A. Martin,. A. Lazzeri and P. Barcelo. 1999. Medium optimisation for efficient somatic embryogenesis and plant regeneration from immature inflorescences and immature scutella of elite cultivars of wheat, barley and tritordeum. Euphytica, 108:161-167.
Barry, G., G. Kishore., S. Padgette., M. Taylor., K. Kolacz., M. Weldon., D. Re., D. Eichholtz., K. Fincher and L. Hallas. 1992. Inhibitors of amino acid biosynthesis: strategies for impairing glyphosate tolerance to crop plants. In ‘Biosynthesis and Molecular Regulation of Amino Acids in Plants,’ eds. Singh, B. K., H. Flores and J. Shannon. pp. 139-45.
Barton, K. A., A. N. Binns., A. J. Matzke and M. Chilton. 1983. Regeneration of intect tobacco plants containing full length copies of genetically engineered T-DNA and transmission of T-DNA to R1 progeny. Cell, 32:1033-1043.
Benkirane, H., K, Sabounji., A. Chlyah and H, Chlyah. 2000. Somatic embryogenesis and plant regeneration from fragments of immature inflorescences and coleoptiles of durum wheat. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 61:107-113.
Binns, A. 1990. Agrobacterium-mediated gene delivery and the biology of host range limitations. Physiologia Plantarum, 79:135-139.
Bieri, S., I. Potrykus and J. Futterer. 2000. Expression of active barley seed ribosome-inactivating protein in transgenic wheat. Theoretical and Applied Genetics, 100:755-763.
Blechl, A. E and O. D, Anderson. 1996. Expression of a novel high-molecular-weight glutenin subunit gene in transgenic wheat. Nature Biotechnology, 14:875-879.
Bliffeld, M., J. Mundy., I. Potrykus and J. Futterer. 1999. Wheat biotechnology. Theoretical and Applied Genetics, 98:1079-1086.
Block, M., D. Debrouwer and T. Moens. 1997. The development of a nuclear male sterility system in wheat. Expression of the barnasegene un
der the control of tapetum specific promoters. Theoretical and Applied Genetics, 95:125-131.